重组溶瘤痘苗病毒在治疗胃癌中的用图
【技术领域】
[00011 本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及一种携带微小RNA microRNA-101的重组溶 瘤痘苗病毒在制备用于治疗胃癌的药物组合物、药物或试剂盒中的用途。
【背景技术】
[0002] 全球所有癌症中，胃癌的发病率在男性中排第四位、在女性中排第五位，胃癌的死 亡率居第二位，5年生存率约20%。发展新型安全有效的治疗方法以提高胃癌患者生存期具 有非常重要的意义。
[0003] 病毒治疗(Virotherapy)是近年来发展非常迅速的一种肿瘤治疗新方法，并已取 得一些令人鼓舞的成果，其中有些在国际上正进行I期和Π 期临床研究。国内有重组人p53 腺病毒(今又生)获得国家食品药品监督管理局颁发的新药证书，临床上用于治疗实体肿瘤 患者。Panl等报道用携带p53基因的溶瘤腺病毒(Oncolytic adenovirus)联合放疗治疗进 展期鼻咽部肿瘤，结果有66.7%患者获得完全缓解(CR)，而单用放疗组CR仅为24.4%。表明 溶瘤病毒是一种有前景的治疗癌症的新方法。溶瘤痘苗病毒(Oncolytic Poxvirus)是病毒 治疗的新型载体，其优点在于:病毒稳定性好、致病性低、基因转染效力高、安全性良好。溶 瘤痘苗病毒能选择性感染肿瘤细胞并在细胞内复制、杀死肿瘤细胞，而对正常组织和细胞 的毒性很小。
[0004] microRNA(miRNA)是一种进化过程中高度保守的、内源性非编码小RNA，广泛地分 布于植物、动物和DNA病毒中。miRNA在转录后水平调控至少30 %的人类蛋白的编码基因，其 功能涉及细胞生长、发育和凋亡等许多复杂生命过程。miR-101发挥作用的方式是引导 miRNA核蛋白体与靶基因的3'非翻译区的结合位点结合，在转录后水平抑制靶标基因的翻 译。miR-101直接作用的靶分子，包括EZH2、Stathmin、DNA甲基化转移酶3A(DNMT3A)。这些靶 分子在细胞中起着促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的功能，miR-101通过多种靶分子的累积 和协同效应介导了肿瘤细胞的过度增殖和凋亡抑制。
[0005] 何晓璞（2012)利用逆转录病毒载体Lenti-virus作为miR-101的转导工具发现， miR-101能引起胃癌细胞生物学行为的改变，而这种改变有可能是通过抑制或沉默C0X-2表 达实现的。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明人发现，现有技术中的治疗癌症的方法效果较弱。为此，本发明要解 决的技术问题是提供一种治疗胃癌的新方法。具体而言，本发明的用于治疗癌症的新方法 包括将携带微小RNA microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒施用于受试者。
[0007] 因此，本发明一方面提供了重组溶瘤痘苗病毒在制备用于治疗癌症的药物组合物 中的用途，其中在所述重组溶瘤痘苗病毒可操作地插入能够编码microRNA-101的外源基 因。
[0008] 编码microRNA-101的外源基因可为SEQ ID NO: 1或其互补序列。
[0009] 另一方面，本发明所述的重组溶瘤痘苗病毒可被进一步修饰，以表达治疗胃癌的 蛋白活性成分。示例性地，本发明中用于表达的治疗癌症的蛋白活性成分是P53。
[0010] 再一方面，本发明中所述药物组合物可含有用于治疗癌症的其他活性成分。示例 性地，其中所述的其他活性成分是紫杉醇。
[0011] 又一方面，本发明的用途中所涉及的药物组合物含有药学上可接受的载体。示例 性地，所述的药物组合物是固体或注射液的形式。优选的，所述的药物组合物是包装在药盒 中的;更优选的，所述药盒还含有所述药物组合物的使用说明书。
[0012] 具体而言，本发明所述的microRNA-101的编码序列是任何能够编码microRNA-101 的任何DNA序列，优选地，该序列为SEQ ID NO: 1或其互补序列。另一方面，本发明所述的 microRNA-101的编码序列可为在严紧条件下与由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列进行杂交、且 编码具有抑制胃癌细胞增值活性的microRNA-101的多核苷酸或其互补序列；
[0013]本文所述的"严紧条件"，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一 种，优选为高严紧条件。示例性地，"低严紧条件"可为30°C、5 X SSC、5 XDenhardt液、0.5% SDS、52 % 甲酰胺的条件；"中严紧条件"可为40°C、5 X SSC、5 X Denhardt液、0 · 5 % SDS、52 % 甲酰胺的条件；"高严紧条件"可为50°C、5 X SSC、5 X Denhardt液、0.5 % SDS、52 %甲酰胺的 条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术 人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多 个因素形成的综合结果来实现相应的的严紧度。
[0014]除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系 统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号6的多核苷酸具有约60%或以上、约70%或以 上、71 %或以上、72%或以上、73%或以上、74%或以上、75%或以上、76%或以上、77%或以 上、78%或以上、79%或以上、80%或以上、81 %或以上、82%或以上、83%或以上、84%或以 上、85%或以上、86%或以上、87%或以上、88%或以上、89%或以上、90%或以上、91 %或以 上、92%或以上、93%或以上、94%或以上、95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以 上、99%或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、 99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、或99.9%或以上同一性的多核苷酸。
[00?5] 核苷酸序列的同一性，可以使用Kar I i η及A 11 s chu 1的算法规则BLAST (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873, 1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发(Altschul SF，et al:J Mol Biol 215:403,1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score = 100、 wordlength = 12;此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score = 50、wordlength =3;使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统可设定默认参数值。
[0016] 任选地，本发明的重组病毒表达已知能抑制胃癌细胞增值的其他蛋白，例如P53。 本发明的药物组合物还可以含有其他治疗胃癌的活性成分，例如紫杉醇。
[0017] 本发明的作为活性成分的携带微小RNA microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒可以 连同药学上可接受的载体一起使用。除活性成分外，本发明的方法、用途和产品还可以包含 合适的药学学上可接受的载体，包括促进本发明的重组病毒加工成制剂的赋形剂和助剂。
[0018] 例如适于注射或输注的制剂包括水性和非水性无菌注射液和水性和非水性无菌 混悬剂，所述无菌注射液可任选地包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与目的接收者的 血液等压的溶质，所述无菌混悬剂可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量或 多剂量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在冻结干燥的（冻干)条件，在立即使用前仅 需要加入无菌液体载体，例如注射用水。
[0019] 本发明的活性成分任选地可与固体赋形剂相组合，并且需要时，在加入合适的助 剂后，加工颗粒的混合物，以获得所需剂型。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、 蔗糖、甘露醇或山梨糖醇;纤维素或淀粉制剂、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维 素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以加入崩解剂，例如交联聚乙 烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。
[0020] 本发明的活性成分的有效量可为治疗胃癌、或缓解胃癌症状或抑制胃癌细胞的任 何量，其可以是相当于约lXl〇 n-lxl〇12V.P重组病毒。有效量的测定在本领域技术人员的能 力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。
[0021] 根据本发明，本发明的药学产品（药物、药剂)或药物组合物可以以任意有效剂量 数施用给药受试者。优选地，本发明的药学产品（药物、药剂)或药物组合物可以以多次剂量 给药，例如从约2至约15次剂量，更优选从约4-10次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的 实施方案，在给药过程中，以每三周给药约一次的频率将本发明的药学产品（药物、药剂)或 药物组合物给药至受试者，例如注射、输注或口服。在特别优选的实施方案，给药为通过注 射施用至荷瘤部位。
[0022]应当理解本发明的药学产品（药物、药剂)或药物组合物可以按用于通过任意适宜 的途径给药的任意适宜的方式配制。
[0023] 本发明的药学产品（药物、药剂)或药物组合物的剂量单位是基于常规进行给药受 试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两 次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。
[0024] 如本文所使用的，"包含"与"包括"、"含有"或"特征在于"同义，并且是包括在内的 或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语"包含"在本文中的任何表 述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或 步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本 发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况 下进行实践。
[0025] 本发明的药学产品中所包含的涉及该药学产品的说明书可以含有如下内容:适应 症(例如胃癌）、施用剂量(例如上述所示例性说明的）以及可能产生的副作用等等。
[0026] 本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述 的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求 保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选 特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰 和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。
[0027] 为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是 对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。
[0028]本发明的有益效果是：
[0029] 1、本发明将恶性肿瘤的基因治疗与病毒治疗有效结合起来，制备了可高效表达 miRNA-101的溶瘤痘苗病毒，相对于单纯的基因疗法或病毒疗法增强了对肿瘤的杀伤能力。 [0030] 2、本发明采用了肿瘤靶向治疗策略，可以有效地靶向肿瘤细胞，并在其中特异性 增殖。从而大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。
[0031] 3、本发明采用病毒复制相关基因缺失的方式，确保病毒的肿瘤内特异性复制，大 大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。
[0032] 4、本发明通过构建携带微小RNA microRNA-101的重组溶瘤痘苗病毒，发挥了较好 的抗胃癌的效果。
【附图说明】
[0033]下面