一种治疗hpv感染的纳米粒制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，涉及一种治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染的纳米粒制剂，尤其 涉及包括聚⑴氨基酯）聚合物和靶向敲除或敲降HPV的重组质粒构成的治疗人乳头瘤病毒 (HPV)感染的纳米粒制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌严重危害妇女健康，占全世界女性恶性肿瘤疾病的第三位。超过85 %的宫 颈癌新发病例和癌症致死病例出现在发展中国家（Jemal A，Bray F，Center MM, et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.)〇
[0003]高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要病因，其中的16和18两种亚型，导 致了70%的宫颈癌。HPV致癌的重要原因是它可以表达E6和E7两种病毒癌蛋白，促进细胞的 增殖，导致癌症的发生。HPV导致宫颈癌是一个漫长的过程，会经历一个宫颈上皮内瘤变 (CIN)时期。HPV通过上皮的微小损伤进入基底层细胞，随着基底细胞向上不断分化表达病 毒基因并在表层组装成新的HPV病毒颗粒，在这个过程中促进上皮细胞的瘤样增生并逐渐 发展为CINl (轻度上皮内瘤变）、CIN2(中度上皮内瘤变)和CIN3(重度上皮内瘤变和宫颈原 位癌）（Woodman CB,Collins SI ,Young LS.The natural history of cervical HPV infection:unresolved issues.Nat Rev Cancer,2007,7(1): 11-22·)。因此，充分利用现 有医药学手段阻断HPV的感染是防治宫颈癌的重要途径。
[0004] 目前医药界已经研发出多种阻断HPV的感染的方法，但仍有很多不足。现有的治疗 HPV感染的药物以干扰素为主，原理是提高组织局部的免疫反应来抗病毒，不是针对HPV的 特异性治疗，并且疗效欠佳。常用的HPV疫苗对HPV亚型的覆盖能力有限，只能预防两种或四 种HPV的感染，能够预防更多种亚型的疫苗还在研发中，但是生产成本也会相应增高。在我 国大陆地区，疫苗迄今为止还没有通过国家药监部门的审批，因此没有投入临床使用，我国 的大部分女性目前没有疫苗接种的机会。另外一种预防宫颈癌的方法是女性定期做宫颈细 胞涂片和HPV筛查。由于健康教育宣传不足和防癌筛查没有纳入医保等原因，经济不发达地 区的女性往往不能定期做宫颈细胞涂片和HPV筛查。而且，即使筛查出HPV感染，现有干扰素 疗法的原理是提高局部组织的免疫反应，并不是针对HPV的特异性治疗，因此效果不佳，也 不能有效地治疗HPV进而预防宫颈癌。
[0005] 近年来，随着基础医学的不断进展，出现了一系列新的具有靶向敲降或敲除HPV的 重组质粒DNA，包括靶向敲降HPV的短发夹RNA( shRNA)重组质粒DNA，靶向敲除HPV的锌指核 糖核酸酶（ZFN) (Sander JD，Dahlborg EJ，Goodwin MJ, et al. Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly(CoDA).Nat Methods, 2010)，转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN)(rmak T，Doyle EL，Christian M，et al.Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.Nucleic Acids Res，2011,39(12) :e82·)，规律成族的间 隔短回文重复重组质粒DNA(CRISPR)等。但是，由于有组织屏障和细胞屏障的存在，单纯的 质粒DNA并不能通过屏障进入细胞发挥作用，因此需要有合适的运载体把质粒DNA带入细胞 内部。对质粒DNA运载体的研究，总体分为两大类，即病毒运载体和非病毒运载体，聚(β氨基 酯)聚合物(简写为PBAE)是一种非病毒运载体。
[0006]病毒运载体虽然具有较高的转染效率，但是仍有很多缺点，比如:可能引起强烈的 机体免疫反应和并发症，载体容量有限，制备要求较高，潜在的致癌性，生物安全性较差等。 因此，研究应用非病毒运载体进行基因靶向治疗是近年来发展的趋势。
[0007]聚（β氨基酯）聚合物是一种分子中含有酯基和可质子化氨基等基团组成的聚合 物，由于聚合条件、聚合物的分子量的不同，表现出的性质也会有所不同。目前已知的聚(β 氨基酯)聚合物家族中大部分聚合物进入细胞的能力较弱、转染效率不高，还有一些聚合物 表现出较高的细胞毒性。因此，对聚⑴氨基酯)聚合物本身进行适当选择是很关键的。
[0008] 在整个转染的过程中，受到影响因素条件的影响较多，例如:细胞外、细胞内的环 境因素，例如ΡΗ、还原性、酶、外界刺激(例如光照、温度）引起的分子结构、表面电荷或是亲 疏水性等变化，聚(β氨基酯）聚合物与质粒组合后的复合物的粒径、电位等。上述列举的部 分影响转染的因素均可以影响或改变聚⑴氨基酯)聚合物与基因的相互作用。
[0009] 聚(β氨基酯)聚合物与质粒需要保持合适的结合能力，如果结合力过低，转染效率 会受到影响;如果结合的太紧密会阻碍DNA在细胞质的释放，对靶向功能的有效发挥产生影 响。因此，并非所有的质粒都可以用于与聚(β氨基酯)组合后进行转染。并不是所有的聚(β 氨基酯)聚合物都适合用于阴道上皮细胞的转染。
[0010]目前还尚未有存在针对HPV感染的由聚(β氨基酯）聚合物和重组质粒构成的纳米 粒制剂。
【发明内容】
[0011] 鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，聚(β氨 基酯)聚合物、靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA以及酸性溶剂作为主要原料，具有特异性 好、转染效率高、毒副作用较低等优点。
[0012] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0013] -种治疗HPV感染的纳米粒制剂，包括聚(β氨基酯）聚合物和靶向敲除或敲降HPV 的重组质粒DNA。
[0014] 优选地，所述聚(β氨基酯）聚合物为由1，4-丁二醇二丙烯酸酯、4-氨基-1-丁醇、ΙΟ-氨丙基 )_4_ 甲基哌嗪三种化合物聚合生成的聚 (β 氨基酯) 聚合物。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016]目前尚未有聚(β氨基酯）聚合物与靶向HPV的重组质粒DNA组合的治疗HPV感染的 纳米粒制剂，本发明首次提供了该制剂。聚⑴氨基酯)聚合物作为体内转染剂，是该制剂的 重要组成部分，有利于将靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA转染到上皮细胞中去。如果只 有靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA的话，转染效果几乎为零，是不能起治疗作用的。
[0017]靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA和聚(β氨基酯）聚合物共同构成基因靶向治疗 的主要组成部分。聚(β氨基酯)聚合物能够有效地把DNA转运至细胞内并释放，它能保护DNA 不被组织和细胞内各种酶降解，它对宿主细胞没有毒性，不会引起较强的免疫反应、制备价 格较低、载体容量多、不具备潜在的致癌性等优点，有利于临床应用转化。带正电荷的聚(β 氨基酯）和带负电荷的靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA作用形成纳米颗粒，通过胞吞作 用进入细胞，再通过内涵体逃逸作用把质粒DNA释放入细胞发挥作用。
[0018] 本发明所述的治疗HPV感染的纳米粒制剂具有较好的HPV靶向性、皮肤黏膜细胞吸 收性，达到对HPV感染的针对性治疗，这是目前临床上主要使用的以干扰素为基础的调节机 体免疫功能的非特异性治疗所做不到的。
[0019] 本发明所述的治疗HPV感染的纳米粒制剂不仅可以清除HPV的感染，而且可以清除 整合的HPV，现有的以干扰素为基础的治疗方法不能清除整合的HPV，因此这是本发明的一 个重要突破。
[0020] 人乳头瘤病毒(HPV)既可以感染女性又可以感染男性，感染女性可以导致宫颈炎、 宫颈上皮内瘤变、宫颈癌，感染男性可以导致尖锐湿疣、口腔癌等。本发明所述的治疗HPV感 染的纳米粒制剂可以制成清洁喷剂供男士和女士使用，分别清除男性和女性的HPV感染，切 断HPV通过性接触等途径传染，这也是本发明的新颖性。
[0021] 本发明所述的治疗HPV感染的纳米粒制剂专一性地清除HPV病原体，对阴道菌群生 态平衡并无影响。既可以用于平时对HPV感染的预防，也可以用于已受HPV感染的感染者的 治疗。目前医药界还没有开发出针对HPV的特异性抗病毒药物，已有的干扰素治疗特异性不 好，疗效欠佳;HPV疫苗只对未感染的患者有远期预防作用，对已感染的HPV不能治疗。本发 明的相关组合制剂，能够解决目前HPV防治工作中的不足，进而降低HPV相关的宫颈癌等疾 病的发病率，具有很好的社会价值。
[0022] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0023]进一步，所述聚⑴氨基酯）聚合物与靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA的质量比 为 20:1 至80:1。
[0024]采取上述进一步技术方案的有益效果为:采用该比例，有利于提高转染的效果。 [0025]进一步，所述靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA选自靶向敲降或敲除HPV的短发 夹RNA重组质粒DNA(shRNA)、靶向敲除或敲降HPV的锌指核糖核酸酶的重组质粒DNA(ZFN)、 靶向敲除或敲降HPV的转录激活因子样效应物核酸酶的重组质粒DNA(TALEN)以及靶向敲除 或敲降HPV的规律成簇的间隔短回文重复的重组质粒DNA(CRISPR)中任一种或几种的混合。
[0026]采取上述进一步技术方案的有益效果为：通过把聚（β氨基酯）聚合物和shRNA、 TALEN、