与质粒混合，静置15-20min，加入96孔板中。 Lipofectmine的转染方法参考说明书。每组试验设置5个副孔。分别24h、48h、72h后测CCK8 检测细胞活性。阳性对照为PEI和lipofectmine;PEI，中文名称为聚乙稀亚胺，购自sigma公 司，货号为408727;lipofectmine 3000,购自Thermo Fisher Scientific公司，货号为 L3000001。
[0125] 根据图1结果表明，阳性对照转染试剂PEI和Iipofectmine的毒性较强，而聚(β氨 基酯）聚合物的毒性很小（聚(β氨基酯）聚合物与绿色荧光质粒(购自addgene，货号60360) 的质量比为20:1至80:1)。
[0126] 实施例8聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒对质粒DNA的保护作用
[0127] 对照组以单纯绿色荧光质粒DNA(pEGFP_Nl，购自addgene，货号60360)为对照。
[0?28] 聚(β氨基酯)聚合物与绿色焚光质粒(pEGFP-Nl，购自addgene，货号60360)的质量 比分别为5:1、10:1、20:1、40:1、60:1和80:1。
[0129] 具体实验方法为：1.取0.1 ug质粒DNA稀释于20uL的25mM乙酸钠溶液中；2.按比例 分别取〇.51^、11^、21^、41^、61^、81^聚（0氨基酯）聚合物稀释于2〇1^的251111乙酸钠溶液中 ； 3.将稀释的聚(β氨基酯）聚合物与稀释后的绿色焚光质粒(pEGFP-Nl，购自addgene，货号 60360)DNA 混合，静置 15-20min。
[0130] 根据图2的琼脂糖凝胶阻滞试验显示，随着聚（β氨基酯）聚合物：绿色荧光质粒 (pEGFP-Nl，购自addgene，货号60360)质量比的增加，聚(β氨基酯）聚合物对质粒的包裹保 护能力也在增加。
[0131 ]实施例9聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒的地貌特征
[0132] 利用原子力显微镜显示聚(β氨基酯)质粒颗粒粒径在纳米级别，从图3中可以看出 合成了较均一的纳米颗粒。
[0133] 实施例10
[0134] 将(β氨基酯)聚合物和红色焚光蛋白质粒纳米(pCAG-RFP-int，购自addgene，货号 19822)粒进行体内转染，具体转染方法为:将(β氨基酯）聚合物和红色荧光蛋白质粒混合， 室温静置15-20min，注射到小鼠阴道，IOug质粒/只，1次/日，连给三次。
[0135] 结果如图4所示，（β氨基酯)聚合物和红色荧光蛋白质粒构成的纳米颗粒转染小鼠 阴道上皮，可观测到红色荧光，证明聚⑴氨基酯)质粒纳米颗粒具有宫颈阴道部位细胞转染 的能力。
[0136] 而二脒基苯基吲哚(DAPI)，出现了核被染成蓝色的实验结果，说明了阴道上皮细 胞核的位置被成功定位。
[0137] 图中的"融合"指的是同一显微镜视野下阴道上皮细胞核与细胞浆的融合，结果是 出了细胞核以外的胞浆部分都有红色荧光，说明了（β氨基酯）聚合物与红色荧光蛋白的结 合物成功转染进入小鼠阴道上皮细胞内并表达。
[0138] 实施例11治疗HPV的聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒治疗效果
[0139] 把聚(β氨基酯）质粒纳米颗粒应用到HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变(CIN)的细胞系 S12上，从图5中可以观察到，质量比60:1的聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒对宫颈上皮内瘤变细 胞S12的生长具有明显抑制作用。
[0140] 实施例12 PBAE转染ΗΕΚ293效率
[0141] 实验方法：1.将Iug的绿色荧光质粒稀释于一定量的25mM乙酸钠溶液中；2.将聚(β 氨基酯)稀释于一定量的25mM乙酸钠溶液中；3.将稀释后的聚(β氨基酯）按照不同的聚(β氨 基酯）：绿色荧光质粒的质量比与稀释的绿色荧光质粒混合，静置15-20min;4.将合成好的 纳米颗粒加入种有HEK293的12孔板中，4-6h后终止转染，更换新鲜培养基，72h后观察转染 情况。
[0142] 发明人在实验过程中意外的发现了聚(β氨基酯)聚合物与质粒的合适的质量比。
[0143] 从图6中可以看出，不同比例条件下的聚(β氨基酯）质粒纳米颗粒在ΗΕΚ293细胞中 都有一定的转染效果，但在60:1的比例条件下转染效率最高，说明在60:1的条件下转染效 果最好。
[0144] 发明人的意外发现得到了进一步的验证。
[0145] 以不同质量比例的聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒为实验组，以PEI为对照组。
[0146] 操作方法为:PBAE的操作方法如上述。1.将Iug的绿色荧光质粒稀释于一定量的 25mM乙酸钠溶液中；2.将将PEI稀释于一定量的PBS中；将稀释后的PEI按照不同比例与稀释 后的质粒混合，静置15-20min，加入种有HEK293的12孔板中，72小时后观察转染情况。
[0147] 从图6中可以看出，不同比例条件下的聚(β氨基酯）质粒纳米颗粒和PEI在HEK293 细胞中都有一定的转染效果，但PEI的转染效率明显低于聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒的转染 效率，说明聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒的转染效果明显高于ΡΕΙ。
[0148] 实施例3中其他的靶向重组质粒DNA与聚(β氨基酯）聚合物混合制成纳米颗粒悬液 经进一步实验验证，也能得到与上述实施例一致的结论。
[0149] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，包括聚(β氨基酯）聚合物和靶向敲除 或敲降HPV的重组质粒DNA。2. 根据权利要求1所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述聚(β氨基酯） 聚合物与靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA的质量比为20:1至80:1。3. 根据权利要求1所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述祀向敲除或 敲降HPV的重组质粒DNA选自靶向敲降或敲除HPV的短发夹RNA重组质粒DNA、靶向敲除或敲 降HPV的锌指核糖核酸酶的重组质粒DNA、靶向敲除或敲降HPV的转录激活因子样效应物核 酸酶的重组质粒DNA以及靶向敲除或敲降HPV的规律成簇的间隔短回文重复的重组质粒DNA 中任一种或几种的混合。4. 根据权利要求3所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述祀向敲除或 敲降HPV的重组质粒DNA的核苷酸序列选自SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7以及SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列中 任一种或几种的混合。5. 根据权利要求1所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述治疗HPV感染 的纳米粒制剂还包括酸性溶剂。6. 根据权利要求5所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述酸性试剂为 乙酸钠，浓度为25mmol，pH为5。7. 根据权利要求1所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，还包括辅料或佐 剂。8. 根据权利要求1至7任一项所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述治 疗HPV感染的纳米粒制剂的剂型为临床可接受的剂型、食品或化妆品。9. 根据权利要求8所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述治疗HPV感染 的纳米粒制剂的剂型选自喷雾剂、洗液、凝胶、胶囊、栓剂、阴道膜、片剂、泡腾片、软膏、霜 剂、含片、咀嚼片、口香糖中任一种。10. -种治疗HPV感染的纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 制备聚(β氨基酯)聚合物； 2) 构建靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA; 3) 将步骤1)制备的(β氨基酯)聚合物溶于酸性溶剂后并与步骤2)构建的靶向敲除或敲 降HPV的重组质粒DNA混匀。11. 一种制备聚(β氨基酯)聚合物的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 称取1，4_ 丁二醇二丙烯酸酯，并溶于二甲基亚砜，混匀，得到混合溶液I; 2) 称取4-氨基-1-丁醇溶于二甲基亚砜，混匀，得到混合溶液II，其中4-氨基-1-丁醇与 1，4_ 丁二醇二丙烯酸酯的摩尔比为1:1.1; 3) 将步骤1)的混合溶液I和步骤2)的混合溶液II混合在一起，避光条件下，升温至40 °C，搅拌反应，得到基础聚合物； 4) 以二甲基亚砜为溶剂配制1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液，将步骤3)得到的基础聚 合物与1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液按照体积比3:2混合，室温搅拌，静置，生成聚(β氨基 酯)聚合物。
【专利摘要】本发明涉及一种治疗HPV感染的纳米粒制剂以及该治疗HPV感染的纳米粒制剂的制备方法。该治疗HPV感染的纳米粒制剂包括：聚(β氨基酯)聚合物、靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA。本发明以聚(β氨基酯)聚合物、靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA作为主要原料，具有特异性好、转染效率高、毒副作用低等优点。
【IPC分类】A61P35/00, A61K47/34, A61K31/7088, A61K48/00, A61K9/14, C08G73/00, A61P31/20
【公开号】CN105535994
【申请号】CN201510999391
【发明人】马丁, 汪辉, 祝达, 沈慧, 胡争, 程静
【申请人】华中科技大学同济医学院附属同济医院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月25日