tricular zone，SVZ)分离的细胞可以产生大 量的神经球（364. 9±53. 5个神经球/孔（六孔板），η = 3,每次计数333-426个神经球； 图7i)。而从背侧中脑分离的细胞基本上不能产生神经球（0. 8±0. 2个神经球/孔（六孔 板），η = 3,每次计数0-1个神经球；图7j)。另外，为了探索P12GFAP+的细胞是否能够在 晚期产生神经元，用 4-OHT 连续 5 天（P12-P16)诱导 GFAP-CreERT2 ;Rosa26-CAG- tdTomato 小鼠表达tdTomato,发现30天后tdTomato仍然不与NeuN共定位（图7k_7n) 〇
[0167] 这些结果表明，从GFAP+诱导的iN细胞来源于出生后的星形胶质细胞，而不是神 经前体细胞。
[0168] 实施例5体内iN细胞的电生理特性
[0169] 为了检测体内iN细胞的电生理特性，对注射病毒后不同时间点的急性脑片进行 全细胞记录。感染的细胞用mCherry的表达来鉴定。
[0170] 结果
[0171] 5. 1感染含Ascll病毒的细胞能够产生动作电位
[0172] 在感染病毒AAV-Ascll/mCherry 7-30天的小鼠脑片中，发现在电压钳模式下， 很多细胞具有内向的Na+电流和外向的K+电流，而且振幅随感染时间的增加而增加（图 llb-lle)。与之对应的是，在电流钳模式下，检测的细胞发放动作电位的能力也随之增强 (图llb-lle)。进一步地，细胞的形态变得更加复杂，biocytin重塑的结果也发现检测的 细胞形成间隙连接也更少（图llb-lle)。与此同时，细胞的输入电阻逐渐增加，而静息膜电 位逐渐降低（图Ilf和Ilg)。这些结果都表明转录因子Ascll体内诱导的iN细胞功能逐 渐成熟。
[0173] 然而，在感染对照病毒AAV-mCherry的小鼠脑片中，发现检测的细胞具有较低的 阻抗（1.88±0. 77ΜΩ，n = 9)，较高的静息膜电位（-79. 21±0. 37mV，n = 14)，不能发放动 作电位（图11a)。同时，生物胞素（biocytin)重塑的结果显示，对照病毒感染的细胞具有 星形胶质细胞的典型形态，并通过间隙连接与邻近的星形胶质细胞相连（图11a)。这些结 果表明，对照病毒AAV-mCherry特异性地在体内的星形胶质细胞中表达，同时它并没有改 变星形细胞的生理特性。
[0174] 5. 2 Ascll诱导产生的iN随着感染时间延长而更易发生动作电位，其产生的电流 能为GABAa受体拮抗剂所阻断
[0175] 根据电流及电压响应模式的不同，将iN细胞分成4组：非活性细胞（non-active)， 具有内向电流但不能发放动作电位的细胞（inward)，能够发放单个动作电位的细胞（sAP) 和能够发放多个动作电位的细胞（mAP)。
[0176] 结果显示，Ascll诱导产生的iN细胞随着感染时间的延长越来越兴奋，感染30天 后所有记录的iN细胞都能够高频（50-220HZ)发放动作电位（图llh)。而对照病毒感染 的细胞都展现出类似星形胶质细胞的"非活性"状态（图Ilh)。进一步观察到iN细胞中存 在自发的突触后电流，随着感染时间的延长，存在自发的突触后电流的iN细胞也越多。在 AAV-Ascll/mCherry病毒感染30天后，发现所有病毒感染的细胞（23/23)上都能检测到高 频的自发突触后电流（图Ili)。
[0177] 进一步的药理实验表明iN细胞既接受兴奋性的谷氨酸输入，也接受抑制性的 GABA输入（图llj)。最后，通过双全细胞记录发现，iN细胞（mCherry+)与中脑顶盖的神经 元（mCherry )可形成突触联系（图Ilk)。加入GABAa受体的诘抗剂bicuculline时，在中 脑顶盖的神经元中所诱发的突触电流被完全阻断（图Ilk)。这说明iN细胞能够与周围的 神经元建立GABA能突触联系，并整合到体内现有的神经环路中。
[0178] 实施例6 Ascll在体内将成年背侧中脑星形胶质细胞转分化为神经元
[0179] 本实验进一步研究了成年小鼠的星形胶质细胞是否可以被重新编程为神经元。将 病毒AAVnCherry或AAV-Ascll/mCherry注射到P60的野生型小鼠中，并显不mChrrey是 否与NeuN共定位。
[0180] 结果
[0181] 6. 1成年小鼠的星形胶质细胞诱导产生的iN细胞可在体内形成功能性突触
[0182] 在注射病毒AAV-Ascll/mCherry的小鼠中，mCherry逐渐与NeuN共定位，从16天 63. 5±3· 1% (η = 3,每次计数 131-266 个细胞）（图 12f和 12f')到 38 天 92. I ± 1. 5% (η = 3,每次计数152-216个细胞）（图12g和12g< )。电生理记录表明，病毒AAV-AscII/ mCherry感染的细胞在感染15-21天后，大多数的iN细胞（9/10)在电压钳模式下具有内向 和外向的电流，并能够发放动作电位（图12h)。同时，大多数的iN细胞（8/10)上可记录到 自发的突触后电流（图12i)。这表明成年小鼠的星形胶质细胞诱导产生的iN细胞可在体 内形成功能性突触。
[0183] 与之相反，在注射5天后，无论是在注射对照病毒AAV-mCherry (4. 2± 1. 4%，η = 3,每次计数 182-216 个细胞；图 12a, a ')或 AAV-Ascll/mCherry (5. 6± I. 6 % , η = 3, 每次计数151-335个细胞；图12e,W )的小鼠中，免疫共标显示mCherry不与NeuN共 定位。随后，实验发现在注射对照病毒AAV-mCherry的小鼠中，不论是在病毒注射16天后 (6·7±3·6%，n = 3,每次计数 236-312 个细胞；图 12b，b')或 38 天后（3. 7± 1. 2 %，η =3，每次计数118-144个细胞；图12c, y )，mCherry基本上不与NeuN共定位。电生理 的实验表明，对照病毒AAV-mCherry感染的细胞具有典型的星形胶质细胞特性（图12d)。
[0184] 由此可见，Ascll在体内可将成年小鼠背侧中脑星形胶质细胞转分化功能性的神 经元。
[0185] 6. 2Cre依赖的Ascll的表达也可以将成年背侧中脑星形胶质细胞转分化成神经 元
[0186] 根据常规技术，制作了 Cre重组酶诱导表达的AAV病毒：AAV-FLEX-NLSGFP和 AAV-FLEX-Ascll/GFP。在AAV载体中含有能够响应Cre重组酶的FLEX序列。将这些腺病 毒注射到成年Aldhlll-Cre转基因小鼠的中脑背侧。
[0187] 经过28天的感染后，AAV-FLEX-Ascl 1/GFP感染的GFP+细胞绝大多数表达 NeuN(90. 1±2. 1%，η = 3,每次计数 126-170 个细胞；图 12k)。另外 AAV-FLEX-NLSGFP 感 染的GFP+细胞绝大多数表达Acsbgl (94. 8± 1.7%，η = 3, 233-268个细胞每次；图13)，这 表明Cre重组酶在星形胶质细胞中特异表达。
[0188] 而对照质粒AAV-FLEX-NLSGFP感染的GFP+细胞几乎不表达NeuN(2. 9± I. 1 %，η =3,每次计数121-181个细胞；图12j)，
[0189] 因此，Cre依赖的Ascll的表达也可以将成年背侧中脑星形胶质细胞转分化成神 经元。
[0190] 6. 3损伤的中脑星形胶质细胞（反应性细胞）可以转分化为功能性的神经元
[0191] 通过用针头注射AAV病毒AAV-mCherry或AAV-Ascll/mCherry造成成年小鼠中脑 背侧的刺伤模型。
[0192] 在AAV-mCherry病毒注射3天后，损伤部位大多数的HiCherry+细胞（92. 8±1· 2%， η = 3,每次计数60-117个细胞；图14a)表达GFAP，而几乎不表达NeuN(2. 4±1.3%， η = 3,每次计数69-107个细胞；图15)。病毒感染30天后，HiCherry+细胞仍然很少表 达NeuN(2. 5±1.2%，η = 3,每次计数78-82个细胞；图14b)。AAViCherry病毒感染的 细胞在30天后有一个相对较小的膜电阻（5. 3±1.9ΜΩ中，n = 6)，更多超极化膜电位 (-81. 2±L 7mV，η = 5)(图14d)，同时不能发放动作电位（图14e)。
[0193] 免疫焚光显不，AAV-Ascll/mCherry病毒感染30天后的HiCherry+细胞大多数表达 NeuN(54. 2±6· 9%，n = 3,每次计数 114-142 个细胞；图 14c)。AAV-Ascll/mCherry 病毒感 染的HiCherry+细胞在30天后具有较大的膜电阻（424. 7±88. 7ΜΩ中，n = 17)和更去极化 的静息膜电位（-61. 2±1. 6mV，η = 17)(图14d)。同时，所有记录的细胞（17/17)都能够 发放多个动作电位（图14f，g)并接受自发的兴奋性和抑制性突触传入。
[0194] 这些结果表明，损伤的中脑星形胶质细胞可以转分化为功能性的神经元。
[0195] 实施例7 Ascll在体内将成年小鼠纹状体星形胶质细胞转分化成神经元
[0196] 为了研究Ascll将星形胶质细胞转分化为神经元是否具有区域特异性，进一步检 查成年小鼠的纹状体星形胶质细胞是否可以被重新编程为神经元。将病毒AAV-mCherry或 AAV-Ascll/mCherry注射到成年野生型小鼠（P60)的纹状体。
[0197] 免疫染色表明大约96%的mCherr/细胞表达星形胶质细胞的标志分子谷氨酰胺 合成酶（GS)(图16e，f)。而mCherry几乎不表达于神经元（NeuN +)、小胶质细胞（ΙΒΑΓ)、 少突胶质细胞（01ig2+)和NG2细胞（NG2+)中（图16a-d，f)。
[0198] 为了确定AAV病毒感染后HiCherry+细胞的性质，进行了 mCherry、GS和NeuN 的免疫三标染色。结果表明，AAV-Ascll/mCherry病毒感染的HiCherry+细胞大多数不 再表达GS(图16h)，而是表达NeuN(64. 4±3. 4%，η = 3,每次计数119-129个细胞；图 17b)。而在AAV-mCherry病毒注射30天后，mCherry+细胞表达GS (图16g)，几乎不表达 NeuN(3. 2±2. 1 %，n = 3,每次计数104-140个细胞；图17a)。这提示星形胶质细胞转分化 成了神经元。
[0199] 为了进一步研究诱导的神经元是否是功能性的，进行了进一步的电生理分析。实 验表明，AAV-Ascll/mCherry病毒感染的HiCherry +细胞在电压钳模式下大多数（15/16)能 检测到向内和外向的电流（图16k)，在电流钳模式下大多数（13/16)能够发放动作电位 (图16k，1)。此外，在这些细胞中大部分（12/16)能够记录到自发的兴奋性和抑制性突触 后电流（图16m)。然而AAV-mCherry病毒感染的细胞在30天后有一个相对较小的膜电阻 (2· 9±1· 0ΜΩ中，n = 7)、更加超极化的膜电位（-79. 0±0· 3mV，n = 7)(图16i)，同时不能 发放动作电位（图16j，1)。这表明，成年小鼠纹状体的星形胶质细胞能转分化为功能性的 神经元。
[0200] 实施例8 Ascll在体内将成年小鼠皮层星形胶质细胞转分化成神经元
[0201] 8. 1本实施例研究了 Ascll是否可以将成年小鼠皮层的星形胶质细胞转分化为神 经元。将病毒AAViCherry或AAV-AsclΙ/mCherry注射到成年野生型小鼠（P60)的躯体感 觉皮层。
[0202] 在病毒注射30天后，实验发现AAV-Ascll/mCherry病毒感染的皮层HiCherry + 细胞绝大部分表达NeuN(93. 9±1.2%，η = 3,每次计数132-147个细胞；图18b)。而 AAViCherry感染的皮层细胞（mCherry+)很少表达NeuN(2. 6±0. 8%，η = 3,每次计数 120-133 个细胞；图 18a)。
[0203] 而进一步的电生理分析发现，AAV-Ascl 1/mCherry病毒感染30的细胞具有较大