保护免受细胞损伤和炎症且促进星形胶质细胞增殖的蛋白激酶C-δ抑制剂的制作方法

专利名称：：保护免受细胞损伤和炎症且促进星形胶质细胞增殖的蛋白激酶C-δ抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及δPKC抑制剂肽治疗脑损伤、特别是创伤性脑损伤(TBI)的应用。在一个实施方案中，δPKC抑制剂肽用于通过促进星形胶质细胞增殖而保护神经组织。
背景技术：
：星形胶质细胞既起保护作用，但是也与多种疾病状态相关。例如，星形胶质细胞是一种认为神经胶质瘤由其起源的细胞类型。星形胶质细胞是神经系统中的重要细胞，其在脑中形成特殊单位(毛细管-星形胶质细胞-神经元单位)以支持神经系统的功能。星形胶质细胞通过以与损伤的严重性有关的渐变方式发生的改变的基因表达、肥大和增殖而响应创伤性脑损伤(TBI)。有利的和有害的作用均已经归因于反应性的星形胶质细胞。研究表明反应性的星形胶质细胞在中度病灶性脑损伤后保护神经组织和限制炎症中起着重要作用。(参见，例如，Myer等，Brain(脑)(2006)129:2761_2772，和Kernie，等，J.Neurosci-Res.(神经学研究杂志)(2001)66(3)317-26.)神经干细胞存留进入成熟期是近年来深入研究的领域。研究表明，在损伤位点的近处和远处区域中均存在神经前体响应创伤性脑损伤的显著增殖。在损伤后60天，近处增殖的结果几乎完全是星形胶质细胞，并且表明新产生的细胞弥补大部分星形胶质增生疤痕。这些数据证明神经增殖在创伤性脑损伤后发生的重建中起重要作用，并且提示关于创伤性脑损伤后的功能恢复如何在损伤本身后很久继续发生的机制。在创伤性脑损伤(TBI)情形中，脑水肿对脑肿胀的贡献仍然为关键问题。炎性反应可能在头部损伤后的脑肿胀中起着基本的作用。研究表明，具有早期水肿形成的针对严重头部创伤的急性反应可能与炎性事件有关，所述炎性事件可能由激活的小胶质细胞和渗透性淋巴细胞引发。很难过高估计这些观察的临床显著性，因为用免疫抑制性药物对具有严重头部损伤的患者的早期和靶向治疗可能导致更加有利得多的结果。蛋白激酶C("PKC")是参与各种细胞功能的信号转导中的重要酶，所述细胞功能包括细胞生长、基因表达的调控，和离子通道活性。PKC同工酶家族包括至少11种不同的蛋白激酶，基于它们的同源性和针对激活剂的敏感性，其可以分成至少3个亚族。每种同工酶包括以同工酶-特异性(“可变”或“V”)结构域间隔的多个同源(“保守”或"C")结构域。“经典”或“cPKC”亚族的成员，α,β”和YPKC，包含四种同源结构域(C1，C2，C3和C4)，并且需要钙、磷脂酰丝氨酸、和二酰甘油或佛波酯来激活。“新的”或“nPKC”亚族的成员，S，ε，η，和θPKC，缺少C2同源结构域，并且不需要钙来激活。最后，“非典型的”或“αPKC”亚族的成员，ζ，λ/iPKC，缺少C2和一半Cl同源结构域，并且对二酰甘油、佛波酯和钙不敏感。对于PKCs在星形胶质细胞募集和增殖中所起的作用理解很少。一个小组报道δPKC在星形胶质细胞迁移中起作用。Renault-Mihara等Mole.Bio.Cell.(分子生物学细胞)(2006)17:5141-5152。然而，该研究存在多种缺陷，并且其结论没有得到充分支持，主要是因为所用的δPKC抑制剂(例如，咖马林)不是对δ同工酶特异性的。Soltoff报道了咖马林是SPKC的不适当且无效的抑制剂。TrendsPharmacolSci.(药理学科学趋势)(2007)28(9):453-8。此外，Mihara等注意到星形胶质细胞是神经胶质瘤，即成年人的主要原始脑瘤起源的细胞类型之一。发明概述本公开的发明涉及特异性抑制δPKC的化合物治疗创伤性脑损伤(TBI)的应用。优选地所述化合物是特异性抑制δPKC的肽。本发明的一个实施方案涉及治疗创伤性脑损伤的方法，所述方法包括通过鉴定TBI症状的存在而鉴定患有创伤性脑损伤(TBI)的受试者，和施用治疗有效量的特异性抑制δPKC活性的肽，由此增加星形胶质细胞活性，并且减轻一种或多种TBI症状。施用可以发生在TBI1-5小时内，并且它可以包含包括δPKC的第一可变区的4-25个残基的肽。备选地，所述肽可以包括δPKC的第五可变区的4-25个残基。该实施方案的另一个方面包括施用与有效促进穿过细胞膜转运的结构部分连接的SPKC肽拮抗剂。适宜的结构部分的实例可以选自由下列各项组成的组=Tat-来源的肽，触角足载体肽，和聚精氨酸肽。在一个优选实施方案中，所述肽为KAI-9803。在本发明的另一个方面中，所述症状包括葡萄糖利用的增加、能量依赖性膜去极化、或大脑代谢速率变化。本发明的另一个实施方案涉及刺激星形胶质细胞活性的方法，所述方法包括向星形胶质细胞群体提供治疗有效量的δPKC抑制肽，由此星形胶质细胞的增殖，相对于未被提供δPKC抑制肽的星形胶质细胞群体而增加。在一个方面中，所述肽包括δPKC的第一可变区的4-25个残基。在优选实施方案中，所施用的肽是ΚΑΙ-9803。在另一个方面中，所述肽包括δPKC的第五可变区的4-25个残基。在另一个方面中，施用步骤包括施用与有效促进穿过细胞膜转运的结构部分连接的SPKC肽拮抗剂。在本发明的另一个方面中，所述结构部分选自由下列各项组成的组=Tat-来源的肽，触角足载体肽，和聚精氨酸肽。附图简述图1显示产生MCAO模型的手术流程的示意图。RCCA右颈动脉；LECA左外颈动脉；LICA左内颈动脉。图2显示用于细胞计算的半影区的示意图。灰色表示缺血中心区。带有红线的白色表示半影。数字1-5表示用于细胞计数和计算的图像区域。图3显示示例KAI9803对大鼠tMCAO的作用的柱状图。在每个时间点，相对于盐水*p<0.01。图4显示示例KAI-9803对半影内神经元损伤的保护作用的线状图。S_N_C盐水组中对侧神经元/星形胶质细胞密度(皮质)；S-N-i盐水组中半影内的同侧神经元密度；K-N-iKAI-9803组中半影内的同侧神经元密度。图5显示示例KAI-9803对半影内星形胶质细胞损伤的保护作用的线状图。S-N-C盐水组中对侧神经元/星形胶质细胞密度(皮质)；S-N-i盐水组中半影内的同侧星形胶质细胞密度；K-N-i:KAI-9803组中半影内的同侧星形胶质细胞密度。图6显示示例KAI-9803对缺血中心内毛细管损伤的保护作用的线状图。图7显示示例KAI-9803对半影内毛细管损伤的保护作用的线状图。图8显示示例KAI-9803对半影内巨噬细胞浸润的保护作用的线状图。图9显示示例KAI-9803处理对半影内增加星形胶质细胞增殖的作用的线状图。发明详述本发明涉及特异性抑制δPKC的化合物治疗创伤性脑损伤(TBI)的应用。在优选实施方案中，所述抑制性化合物是特异性抑制SPKC的肽。“δPKC抑制剂”是能够抑制δPKC同工酶的酶活性和其它功能活性的任意化合物，包括小分子和肽。特异性δPKC抑制剂是超过另一种显著抑制SPKC同工酶的任意化合物。本发明的具体方面涉及δPKC抑制化合物对星形胶质细胞活性的调节性影响。术语“星形胶质细胞活性”包括星形胶质细胞代谢，星形胶质细胞迁移，(例如，位点浸润)，以及星形胶质细胞增殖的组成。在优选实施方案中，通过所述方法治疗的TBI不是由卒中(stroke)引起的。除非另外指明，下文讨论的TBI不是由卒中引起的。本发明还设想通过监测星形胶质细胞活性诊断测量脑损伤和治疗TBI。尽管不希望受到任何具体理论的束缚，本发明的优选实施方案涉及在患有TBI的受试者的脑中增加星形胶质细胞活性。星形胶质细胞是脑中的神经胶质细胞。星形胶质细胞在脑中起多种不同的作用，例如，星形胶质细胞通过形成血脑屏障的一部分而包括脑的一部分物理结构。星形胶质细胞滋养神经组织，例如，通过为神经元提供营养。还报道星形胶质细胞在神经递质再吸收和释放中起作用。认为星形胶质细胞调控胞间隙内的离子浓度并且调控血液流动。可能最重要的是，星形胶质细胞被认为在修复脑损伤中起作用。例如，在脑梗死或创伤以及在损伤部位发育坏死组织后，星形胶质细胞和其它细胞被认为群集在损伤空间，并且稳定受损伤的区域且促进其修复。认为SPKC抑制肽的应用刺激星形胶质细胞和其它细胞响应TBI所起的修复作用。在一个实施方案中，SPKC抑制肽用来在有此需要的受试者中诱导星形胶质细胞增殖或创伤性脑损伤的浸润。损伤机制下述损伤机制代表最常见的TBI起因。这些机制包括开放性头部损伤，闭合性头部损伤，减速性损伤，化学品/毒性，缺氧，肿瘤。感染和卒中。出于举例说明的目的提供下述机制，并且这些机制的描述不意欲限制权利要求的范围。由伤口，诸如子弹伤口和其它头骨穿透导致的开放性头部创伤代表TBI的主要原因。由跌倒、机动车辆碰撞和由爆炸、钝力创伤、或其它外力引起的震荡导致的闭合性头部损伤是TBI的另一种主要原因。当在空间运动的头骨减速而其中围住的大脑继续飞快运动时，发生减速性损伤(弥漫性轴索损伤)。头骨和大脑的区别性运动可以导致切应力、挫伤和脑肿胀。这种切应力可以损伤轴索，并且导致神经元死亡。脑暴露于多种化学品可以引起TBI，以及缺氧、肿瘤、感染和卒中。TBI的症状包括在损伤后的最初30分钟内葡萄糖利用的显著增加，之后葡萄糖吸收减少，和然后保持在低水平约5-10天。还已经报道TBI增加膜渗透性和连续的水肿形成。ATP-储备被消耗，并且存在能量依赖性膜去极化的失败。除了糖酵解障碍之外，TBI还可以在脑创伤之后导致氧化代谢的损害。例如，严重头部损伤的患者经常表现出大脑乳酸中毒。大脑血流动力学在损伤后显著变化，并且这些变化的模式取决于损伤的类型及其严重性。还报道TBI引起中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质谷氨酸的快速释放。(见Madilians禾口Giza，IndianJournalofNeurotrama(印度神经仓ij伤杂志)(2006)3:9_17。大脑血流动力学和代谢可以使用正电子发射体层摄影术(PET)进行测量，如在Yamaki等J.Nucl.Med.(核酸医学杂志)(1996)37(7):1170_2中所讨论的。代谢测量包括局部大脑血液流动(rCBF)，氧提取馏分(rOEF)，大脑血液体积(rCBV)，大脑氧代谢速率(rCMR02)，大脑葡萄糖代谢速率(rCMRglc)和大脑代谢比率(rCMR02/rCMRglc)。格拉斯哥昏迷等级得分(GlasgowComaScalescores)和计算机体层摄影术(CT)的应用也可以用来诊断TBI。δPKC抑制剂本发明包括抑制δPKC活性的化合物，诸如小分子和肽。PKC的小分子抑制剂记述在美国专利号5，141，957，5，204，370，5，216，014，5，270，310，5，292，737，5，344，841，5，360，818，5，432，198，5，380，746，和5，489，608，(欧洲专利0，434，057)中，所有这些通过引用完全结合于此。这些分子属于下述种类N，N'-二_(亚磺酰氨基)-2-氨基-4-亚氨基萘-1-酮；N，N'-二_(酰胺基)-2_氨基-4-亚氨基萘-1-酮；连位取代的碳环；1，3-二噁烷衍生物；1，4_二-(氨基-羟烷基氨基)_蒽醌；呋喃香豆素磺酰胺；二_(羟烷基氨基)_蒽醌；和N-氨基烷基酰胺，2-[1-(3-氨基丙基)-IH-吲哚-3-基]-3-(1Η-吲哚-3-基)马来酰亚胺，2-[1-[2-(1_甲基吡咯烷)乙基]-IH-吲哚-3-基]-3-(1Η-吲哚-3-基)马来酰亚胺，G57874。PKC的其它已知的小分子抑制剂记述在下述公布中(Fabre,S.，等1993.Bioorg.Med.Chem.(生物有机医学化学)1，193，Toullec，D.，等1991.J.Biol.Chem.(生物化学杂志)266，15771，Gschwendt,M.，等1996.FEBSLett.(FEBS通信)392，77，Merritt,J.E.，等1997.CellSignal(细胞信号)9，53.，Birchall,A.M.，等1994.J.Pharmacol.Exp.Ther.(药理学实验治疗杂志)268,922.Wilkinson,S.Ε·，等1993.Biochem.J.(生物化学杂志)294，335.，Davis,P.D.，等1992.J.Med.Chem.(医学化学杂志)35，994)，并且属于下述种类2，3_二(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺(二吲哚基马来酰亚胺IV)；2-[1-(3_二甲基氨基丙基)-5_甲氧基吲哚-3-基]-3-(1Η-吲哚-3-基)马来酰亚胺(Go6983)；2-{8-[(二甲基氨基)甲基]_6，7，8，9-四氢吡啶并[1,2-a]吲哚-3-基}-3-(1-甲基-IH-吲哚-3-基)马来酰亚胺(Ro-32-0432)；2_[8_(氨基甲基)-6，7，8，9_四氢吡啶并[l，2-a]吲哚_3_基]-3_(1-甲基-IH-吲哚-3-基)马来酰亚胺(Ro-31-8425)；和3_[1_[3_(脒基硫代)丙基-IH-吲哚-3-基]-3-(1-甲基-IH-吲哚-3-基)马来酰亚胺二吲哚基马来酰亚胺IX，甲磺酸酯(Ro-31-8220)，所有这些通过引用完全结合于此。本发明还设想有效抑制δPKC且能够刺激星形胶质细胞增殖或TBI位点浸润的肽的应用。如本文所讨论的，所述抑制肽通常称为“货物”肽。在本领域中已经描述了多种抑制性δPKC肽，诸如记述在美国专利号6，855，693，美国专利申请号20050215483和美国临时专利申请号60/881，419和60/945，285中的那些，所有这些通过引用结合于此。δPKC抑制肽起δPKC的易位抑制剂作用，其在被处理的细胞中作用为减少δPKC活性。应该理解，所述抑制肽可以以天然形式应用或通过与促进细胞吸收SPKC抑制肽的载体缀合进行修饰。对该肽的修饰实例可以在美国临时申请号60/881，419和60/945，285中找到，二者均通过引用完全结合于此。例如，当载体和货物肽通过二硫键连接时，可以用高Cys残基替代Cys。另外，设想对货物、载体、或这两种肽的氨基和羧基末端加帽，如在引用的申请中充分解释的那样。设想将来源于该酶的第一和第五可变区的肽用作用于本文所述的方法的抑制肽。所述肽优选长度为4-25个残基，更优选长度为6-25个残基，且更优选长度为6-12个残基。另一个优选的实施方案设想应用长度为6-8,910，11，12，13，14，15，16，17，18，19,20,21,22，23，24，或25个残基的肽，排除用于连接所述货物和载体序列的残基，诸如Gly-Gly二聚体，或一个或多个用于形成二硫键的Cys残基。应该理解，与天然序列同源的肽和具有保守氨基酸取代和/或并列的肽，以及保留活性的片段，在所设想的肽的范围内。例如，可以取代一个或多个氨基酸(优选不超过两个)，在R和K之间；V，L，I，R和D之间；和/或G，A，P和N之间变化。因此，术语“δPKC抑制肽”考虑天然序列及其保留所需要的活性的所有修饰物、衍生物、片段、组合、和杂化物。下述序列对应δPKC的Vl和V5结构域以及由其来源的示例性片段。下文还描述了一些示例性的修饰的肽，其中取代以小写字母显示。在所有情形中，应该理解设想了来源于且同源于本文明确所示的那些的序列(例如，来自其他物种的亲密同源序列)。本文所述的所有肽均可以利用本领域已知的自动或手动固相合成技术通过化学合成来制备。所述肽还可以利用本领域已知的技术重组制备。以下提供优选的δPKCVl抑制肽的表格。表1示例性δPKCVl抑制肽<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>KAI-9803是一种已经表明是δPKC活性的有效抑制剂的选择性δPKC抑制剂。同样，该肽构建体代表优选实施方案。术语“ΚΑΙ-9803”是指来源于通过Cys-Cys二硫键与HIVTat-来源的转运肽缀合的δPKC的第一可变区的肽，并且可以表示如下H2N-Cys-Ser-Phe-Asn-Ser-Tyr-Glu-Leu-Gly-Ser-Leu-COOH(δPKC肽)I(SEQIDNO107)SI(二硫键)SI(SEQIDNO108)H2N-Cys-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-COOH(载体)(SEQIDNO109)。下文提供抑制肽的其他实施方案C-S-F-N-S-Y-E-L-G-S-L(SEQIDNO110)SI(二硫键)SC-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R(SEQIDN0:111)C-E-L-G-S-L-Q-A-E-D-D(SEQIDNO112)SI(二硫键)SC-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R(SEQIDN0:111)C-S-F-N-S-Y-E-L-G-S(SEQIDNO113)SI(二硫键)SC-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R(SEQIDN0:111)C-S-F-N-S-Y-E-L-G-S-L(SEQIDNO114)SI(二硫键)SAc-C-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R-NH2(SEQIDNO115)C-S-F-N-S-Y-E-L-G-S(SEQIDNO:113)SI(二硫键)SAc-C-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R-NH2(SEQIDNO:115)C-E-L-G-S-L-Q-A-E-D-D(SEQIDNO:116)SI(二硫键)SAc-C-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R-NH2(SEQIDNO:115)Ac-G-S-F-N-S-Y-E-L-G-S-L-G-G-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R-NH2(SEQIDNO117)C-S-A-N-S-Y-E-L-G-S-L(SEQIDNO:118)SI(二硫键)SAc-C-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R-NH2(SEQIDNO:115)C-N-S-Y-E-L-G-S-L(SEQIDNO:119)SI(二硫键)SAc-C-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R-NH2(SEQIDNO:115)KAI-9803已经在其中表现出益处的临床前模型包括大鼠中的体外综合心脏缺血和再灌(InagakiK.，等，Circulation(循环)2003PP:869)，猪中的体内局部左前降支(LAD)冠状动脉闭塞和再灌(InagakiK.，等，Circulation(循环)2003pp2304)和大鼠中的体内中脑动脉闭塞(MCAO)(BrightR.，等，J.Neuroscience(神经科学杂志)2004)。由于KAI-9803在再灌损伤临床前模型中表现出的有前景的功效，KAI制药进一步研究了KAI-9803在缺血性卒中动物模型中的作用，以确定对δPKC发展的抑制是否还在使用静脉内推注或输注施用保护脑免受缺血再灌诱导的损伤中有效。大鼠中的缺血性卒中的瞬时和永久性中脑闭塞(MCAO)模型均用来检测KAI-9803的剂量响应潜力和功效。δPKC同工酶的V5结构域具有氨基酸序列“PKVKSPRDYSNFDQEFLNEKARLSYSDKNLIDSMDQSAFAGFSFVNPKFEHLLED〃(SEQIDNO120)ο示例性的肽包括取自氨基酸残基624-631的VKSPRDYS(SEQIDNO121),PKVKSPRDYSN(SEQIDNO122)，和修饰的肽VKSPcRDYS(SEQIDNO123)和iKSPR.sub.IYS(SEQIDNO124)。载体肽术语“载体”是指促进细胞吸收，诸如阳离子聚合物、肽和抗体序列的结构部分，包括聚赖氨酸、聚精氨酸、触角足-来源的肽、HIVTat-来源的肽等如记述在，例如，美国专利和公布号4，847，240，5，888，762，5，747，641，6，316，003，6，593，292，US2003/0104622,US2003/0199677和US2003/0206900中。另一种公知的载体肽序列是“聚_Arg”序列。参见，例如，美国专利号6，306，993，其也通过引用完全结合于此。载体结构部分的一个实例是“载体肽”，其是促进细胞吸收与转运肽化学缔合或键合的δPKC抑制肽的肽。在许多情形中，利用二硫键来连接载体和货物肽，产生治疗性肽构建体。在所述实施方案中，货物和载体肽通过Cys二硫键连接。Cys残基可以位于所述肽的N端、C端或内部。另一种改善肽组合物稳定性的策略包括与通过二硫键连接所述肽相反，将货物和载体肽连接成单一的肽。示例性的载体肽为YGRKKRRQRRR(SEQIDNO:125)。对二硫键和其他连接策略的修饰的实例在美国临时申请号60/881，419和60/945，285中讨论，二者通过引用完全结合于此。MM所述肽通过与药用载体或稀释剂组合来制备，以用于施用。因此，本发明的另一个方面提供药物组合物，其包含采用用于施用给受试者的剂型的本发明的肽。所述剂型包括，但不限于，用于口服施用的片剂、胶囊、混悬液、糖浆，其中适宜的药物载体包括甘露糖醇、葡萄糖、淀粉、乳糖、滑石、硬脂酸镁、水溶液、油-水乳液等。其他剂型包括鞘内的、静脉内的、肌内的、皮下的，其中适宜的药物载体包括缓冲水性或非水性介质。示例性的制剂可以在美国专利号7，265，092中找到，其通过引用完全结合于此。所述肽可以局部施用(例如，在炎症或外周神经损伤位点附近)，例如，通过局部敷用、皮内注射或药物递送导管进行。组合物中的肽的量可以改变，以便获得适当的剂量，并且实现治疗效果。剂量将取决于多种因素，诸如施用途径、治疗的持续时间、患者的块头和身体条件、该肽的潜力和患者的响应。所述肽的有效量可以通过在本领域已知的一种或多种模型中检测该肽来确定，所述模型包括本文所述的那些。所述肽可以在需要时，以每小时、每天数次、每日一次、或如人经历疼痛一样频繁或该人的医师认为适当的那样来施用。所述肽可以以进行性基础施用，以管理慢性适应证，或者可以在急性适应证之前或之后以短期基础施用。本发明的肽可以单独或与载体肽如Tat载体肽连接进行施用。其他适当的载体肽是已知的且设想的，诸如果蝇触角足同源域(Theodore，L.，等.J.Neurosci.(神经科学杂志)157158(1995)Johnson,J.Α.，等，Circ.Res.(循环研究)791086(1996b))，其中所述PKC肽通过N端Cys-Cys键与触角足载体交联。聚精氨酸是另一种示例性的载体肽(Mitchell等，J.PeptideRes.(肽研究杂志)，56318-325(2000)；Rothbard等，NatureMed.(自然医学)，6:1253-1257(2000))。使用方法不限于任何具体的作用模式，认为本发明的肽起δPKC的易位抑制剂的作用，从而防止由于创伤性脑损伤导致的细胞损伤。应该理解，所述肽可以以天然形式使用或通过与载体，如上述那些缀合进行修饰。备选地，来自该序列的1个或2个氨基酸可以被取代或缺失，并且下文提供关于每种肽的示例性的修饰物和衍生物以及片段。在所述肽为缀合物的一部分的情形中，所述肽典型地通过Cys-Cys键与载体肽缀合，所述载体肽如Tat-来源的转运多肽，聚精氨酸，或触角足肽。在另一个一般实施方案中，所述肽可以利用载体或包封剂，诸如脂质体介导的递送中的脂质体，引入至细胞、组织或完整器官中。所述肽可以是(i)化学合成的或(ii)在宿主细胞中使用，例如，包含编码所述肽的多核苷酸片段的表达载体重组产生的，其中多核苷酸片段可操作地连接至能够在宿主细胞中从该片段表达mRNA的启动子上。在另一个方面中，本发明包括减轻创伤性脑损伤的方法，在优选实施方案中，所述创伤性脑损伤不包括由卒中引起的TBI。所述方法包括引入治疗有效量的同工酶特异性SPKC拮抗剂，或上述这些肽的任意修饰物、衍生物、和片段。所述δPKC拮抗剂抑制SPKC，由此导致通过减轻TBI保护脑细胞、组织或完整器官。TBI的减轻，相对于由没有进行SPKC拮抗剂肽治疗的相应脑细胞、组织或完整器官经受的损伤来测量。应该理解，施用的肽剂量将取决于受试者的状况、施用的时间(即，所述肽是在TBI诱导的事件之前、之中还是之后施用)而变化。本领域的普通技术人员能够利用，例如，在本文所述的完整器官和动物研究中所有的剂量来确定适当的剂量。所述方法可以用多种中枢神经系统(CNS)细胞(例如，神经元、神经胶质细胞)实施。所述肽可以体外、体内或离体地施用给细胞、组织或完整器官。考虑所有的施用模式，包括静脉内的、肠胃外的、皮下的、吸入的、鼻内的、舌下的、黏膜的、和经皮的。优选的施用模式是通过动脉输注或再灌至靶器官。提供下述实施例以举例说明而不是限制本发明。实施例1δPKC抑制剂对卒中TBI的影响先前的研究已经表明，选择性KAI-9803在再灌24小时评估的大鼠瞬时中脑动脉闭塞(MCAO)卒中模型中减小脑梗死的尺寸。该研究的目的是在7天恢复过程中的大鼠MCAO模型中，评估经由静脉内(IV)推注注射使用13.4mg/kg剂量的KAI-9803的短期处理通过抑制细胞损伤或炎症反应或通过促进星形胶质细胞增殖而提供延长的保护作用的能力。用KAI-9803短期处理导致再灌24小时时的梗死尺寸31%的减小(处理组36.7%相对于盐水组53.2%，ρ<0.01)。在KAI-9803-处理组中，而不是在盐水组中，在再灌3和7天时观察到梗死尺寸的进一步减小(在第3天梗死尺寸32.9%相对于50.2%，在第7天梗死尺寸25.3%相对于50.0%，p<0.01)。在再灌1天时观察的半影中，KAI-9803的处理保护免受神经元和星形胶质细胞损伤(对于神经元303士25/mm2相对于105士12/mm2，对于星形胶质细胞132士21/mm2相对于78士8/mm2，p<0.01)。缺血中心和半影中的巨噬细胞浸润在再灌1天后发生，并且显著增加直到再灌7天时。KAI-9803的处理在7天中导致半影中巨噬细胞浸润的50%减少。在再灌1天时，KAI-9803在缺血中心和半影中保护免受由于缺血性再灌损伤导致的毛细管损伤，并且在再灌7天内增强毛细管密度逆转(毛细管密度在再灌第3天时，在半影中269士ΙΟ/mm2相对于178士6/mm2，和在缺血中心中375士26/mm2相对于248士15/mm2)。在再灌3天后，在KAI-9803-处理组中，半影中的星形胶质细胞的增殖(Ki67-阳性星形胶质细胞)显著高于盐水对照中的(P<0.01)。数据表明，KAI-9803不仅在再灌1天时减轻半影中的脑细胞损伤，毛细管损伤和巨噬细胞浸润，而且促进缺血中心和半影中的星形胶质细胞增殖，增强缺血中心和半影中的毛细管密度恢复，其可能有助于坏死的脑组织的康复，这表明KAI-9803对于缺血性卒中的延长的保护作用。材料和方法1.测试化合物KAI-9803API(LotNo.U0703AI，肽含量为80%)获自美国肽公司(AmericanPeptideCompany)且保存在设定为_20°C的医学用冰箱中。2.动物雄性SpragueDawley大鼠购自查尔斯河实验室(CharlesRiverLaboratories)(要求的购买重量为250275g)。将动物保持在控温环境中，在所有时间使用恒定的自然12小时亮/12小时暗循环以及充足的食物和水。使用动物的所有实验步骤在AKI动物研究机构中按照IA⑶C指南进行。3.手术流稈动物麻醉通过吸入具有氧气的2.5%异氟烷而诱导全面的麻醉，并且在整个手术流程中保持具有氧气的2.5%异氟烷。中脑动脉闭塞进行颈中腹部皮肤切口，并且分开和牵引肌肉组织以暴露左颈动脉。借助于手术显微镜，显现左颈动脉的外部和内部分支。外部颈动脉双结扎。结扎临近分叉点的左颈总动脉，并且远离该结扎进行动脉切开术。闭合的3-0单丝线前移进入左内部颈动脉分支，以使单丝的末端位于左中脑动脉的起点，并且使动脉血流闭塞进入左中脑动脉(图1)。将闭合线在合适的位置缝合以闭合血管。缝合是永久的或暂时的，这取决于设计的实验。去掉牵引，肌肉组靠近，并且用2-0蚕丝缝合线闭合皮肤切口。对于暂时性缺血(再灌模型)，在缺血2小时后，去除闭合的3-0单丝，产生再灌模型。在缺血期间，监测，并且利用加热毯和/或麻醉调整保持生理参数，包括体温(36-38°C)和呼吸速率。手术后管理手术后，缝合切口，并且用湿纱布擦拭大鼠毛皮，以去除血液并且仔细晾干。将大鼠放回容纳区，并且将其独自置于具有水和食物的笼中至少4小时。密切观察大鼠，直至大鼠从手术恢复，然后转移至笼中，直至可与用于实验的持续时间的其他大鼠相比。4.药物施用测试的物品在盐水中复原，并且通过经由尾静脉的静脉内(IV)推注注射施用。注射体积为1.OmL,以限制对动物的体积状况的影响。5.实验组为了本研究设计两组。组1是在瞬时MCAO模型中在再灌开始时通过尾静脉IV推注施用盐水。所有的动物随机分成3组；再灌1、3和7天。组2在瞬时MCAO模型中在再灌开始时通过尾静脉IV推注施用剂量为13.4mg/kg的KAI-9803。所有的动物随机分成3组；再灌1、3和7天。6.动物处死和脑样品制备在实验结束时，通过在深度麻醉(5%异氟烷)下打开胸腔处死在盐水和KAI-9803处理组中再灌1天的动物，由此诱导呼吸和心博停止。将脑小心取出，并且切成相等厚度的5片(厚度为2.5mm;标记切片1-5，其中切片#1对应脑的前部，和#5对应脑的后部)。在室温下将所有切片用2%2，3，5_三苯基四唑氯化物(TTC)离体染色10分钟，并且在室温下(200C)保存在处于0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中的4%低聚甲醛(PFA)中，用于照片成像和组织学研究。在盐水和KAI-9803处理组中再灌3和7天的动物在处死前1小时接受BrdU(50mg/kg)的IP注射。然后，将动物通过过量的戊巴比妥IP注射(100mg/kg)处死，在室温(20°C)下用4%PFA溶液进行灌注固定10分钟。固定后，小心取出脑，并且切成相等厚度的5片(厚度为2.5mm)。处理所有的切片用于照片成像和组织学分析。7.组织化学和免疫组织化学染饩处理所有的脑组织以用于石蜡包封和切成8-10μm的厚度。进行常规H&E和甲苯胺蓝染色。对于星形胶质细胞(GFAP)，巨噬细胞(EDl)和毛细管(CE31)进行免疫组织化学(IHC)染色，对于细胞增殖(Ki67和BrdU)进行IHC。进行Ki67/GFAP和BrdU/GFAP双染色，以评估星形胶质细胞的增殖。8.数据分析梗死尺寸计算在再灌24小时的梗死尺寸使用同我们先前进行的相同方法(见卒中报道)确定同侧脑半球的梗死尺寸的数据分析。在再灌3天和7天的梗死尺寸扫描H&E染色的脑切片(5片，10μm厚)(HPScanjet；模式3970；像素1200)，并且保存为Photoshop图像。使用同我们先前进行的相同方法(见卒中报道)确定同侧脑半球的梗死尺寸的数据分析。细胞计算细胞计算集中在皮质区域(图2)。半影中的神经元和星形胶质细胞的密度从甲苯胺蓝染色的切片选择5个不同的半影区域(高放大倍数，X400；0.08mm2)以用于计算。存活神经元的评估人工计数正常表现的神经元数目。正常神经元定义为无论是否具有颜色变深的细胞质但具有浅色的细胞核的神经元。显示颜色变深的细胞质和细胞核的神经元，有或无核固缩，被解释为损伤神经元，并且将其排除。存活神经元定义为每mm2脑组织的神经元数目。存活星形胶质细胞的评估人工计数正常表现的星形胶质细胞数目。正常的星形胶质细胞定义为具有异染色质窄边和不显眼的细胞质的椭圆形表现的细胞核。星形胶质细胞定义为每mm2脑组织的星形胶质细胞数目。缺血中心和半影中的毛细管密度的评估从⑶31IHC染色的切片选择5个不同的缺血中心和半影区域(高放大倍数，χ400;0.08mm2)，以用于计算。人工计数⑶31阳性染色的毛细管数目。毛细管定义为每mm2脑组织的⑶31-阳性毛细管数目。半影中巨噬细胞浸润的评估从EDlIHC染色的切片选择5个不同的半影区域(高放大倍数，χ400；0.08mm2),以用于计算。人工计数EDl阳性染色的细胞数目。巨噬细胞定义为每mm2脑组织的EDl-阳性细胞数目。星形胶质细胞增殖评估半影中的星形胶质细胞增殖从Ki67/GFAP和BrdU/GFAP双重IHC染色的切片选择5个不同的半影区域(高放大倍数，χ400；0.08mm2)，以用于计算。人工计数Ki-67阳性染色的星形胶质细胞数目。增殖的星形胶质细胞定义为每mm2脑组织的Ki-67/GFAP-阳性细胞数目。人工计数BrdU阳性染色的星形胶质细胞数目。原位增殖的星形胶质细胞定义为每mm2脑组织的BrdU/GFAP-阳性细胞数目。9.排除从分析中排除这样的动物，条件是它们在手术或再灌期间死亡，或者梗死尺寸非常小(<10%)，这表明闭塞(缺血)是无效的。10.统计学分析对来自每组的数据进行平均，并且确定均值的标准偏差和标准误差(=stdev/sqrt(n))。利用post-hocDurmett检验通过单向ANOVA使给药组与对照组进行比较。认为P<0.05是统计学显著的。MM在瞬时MCAO模型中以13.4mg/kR的剂量作为IV推注施用的KAI-9803处理的效果对经历2小时左侧MCAO及随后再灌1天的大鼠在再灌开始时通过尾静脉推注注射用KAI-9803进行处理。与盐水对照相比，在再灌24小时时，用13.4mg/kgKAI-9803处理的大鼠表现出统计学显著的梗死尺寸减小(36.7%相对于53.2%，ρ<0.01)。还在再灌后3天和7天后，在KAI-9803-处理组中，而不在盐水组中观察到梗死尺寸的进一步减小(在第3天，梗死尺寸32.9%相对于50.2%，且在第7天梗死尺寸25.3%相对于50.0%，p<0.01)，这表明KAI-9803在再灌开始时作为IV推注施用而施用时对神经元组织的保护作用(图3)。KAI-9803对半影中针对神经元和星形胶质细胞损伤的保护作用的效果在再灌1天时在半影中观察到KAI-9803处理的神经元保护作用，这表现为存活神经元密度在处理组中为303士25/mm2，大于盐水处理组的105士12/mm2(p<0.01)(图4)。在再灌第7天，处理组中的神经元密度略微增加，这可能是由于损伤的脑组织的康复。类似地，在再灌1天时，星形胶质细胞的保护作用也观察到在处理组中为132士21/mm2的，高于盐水组的78士8/mm2(p<0.01)(图5)。在再灌3天后，在处理组和盐水对照组中，半影中星形胶质细胞的密度均显著增加，这表现为在处理组中比在盐水组中更加显著得多的增加(在第3天，177士18/mm2相对于110士11/mm2，ρ<0.01；在第7天，194士9/mm2相对于127士6/mm2，ρ<0.01)。ΚΑΙ-9803对缺血中心和半影中针对毛细管损伤呆护作用的效果通过ΚΑΙ-9803处理，显著限制了缺血中心和半影中缺血-再灌诱导的毛细管损伤。缺血-再灌损伤导致显著的毛细管损伤评分，表现为在盐水组中，缺血前的419士7/mm2相对于再灌24小时时的145士15/mm2。ΚΑΙ-9803的处理减轻缺血中心的毛细管损伤(缺血前的431士11/mm2相对于再灌24小时时的272士17/mm2)。使用KAI-9803的处理，在再灌3天和7天时，在缺血中心内的毛细管密度逆转接近缺血前的水平。然而，这种逆转在盐水组中很慢且较少的(图6)。在半影中的毛细管密度表现出与在缺血中心中相似的变化，但较少的逆转(图7)。这些数据表明在缺血中心中较高的毛细管密度可能是由于在该区域中较高的血管生成。在损伤早期时的毛细管保护和后来的血管生成将有助于以后的损伤康复，尤其是缺血中心的康复。KAI-9803对半影中针对巨卩策细胞if润的{呆护作用的效果在再灌1天时识别到缺血中心和半影中的巨噬细胞浸润。在再灌3天后，在缺血中心和半影的板(board)上出现显著的巨噬细胞浸润。它们在恢复期过程中，迁移到缺血中心中。与KAI-9803处理组相比较，巨噬细胞浸润广泛出现在盐水组中的半影中。KAI-9803的处理经过再灌7天导致巨噬细胞浸润50%的减少(图8)。KAI-9803的处理增加半影中的屋形胶质细胞j曾歹言半影中的Ki67_阳性细胞指示在缺血再灌损伤后的细胞增殖，该细胞主要是星形胶质细胞和其它神经胶质细胞。使用KAI-9803处理的半影组织，经过再灌7天，表现出与盐水组相比更多的Ki67-阳性细胞(图9)。为了理解星形胶质细胞增殖指数，进行Ki67/GFAP和BrdU/GFAP双重IHC染色。参考文献1)InagakiK.，等Circulation(循环)108:869_875(2003)2)InagakiK.，等Circulation(循环)108:2304_2307(2003)3)BrightR.，等J.Neuroscience(神经科学杂志)24(31):6880_6888(2004)权利要求治疗创伤性脑损伤的方法，其包括通过鉴定TBI症状的存在而鉴定患有创伤性脑损伤(TBI)的受试者，和施用治疗有效量的特异性抑制δPKC活性的肽，由此增加星形胶质细胞活性并且减轻一种或多种TBI症状。2.权利要求1的方法，其中所述施用发生在TBI1-5小时内。3.权利要求1的方法，其中所述肽包括δPKC的第一可变区的4-25个残基。4.权利要求3的方法，其中所述肽包括δPKC的第一可变区的6-25个残基。5.权利要求1的方法，其中所述肽包括δPKC的第五可变区的6-25个残基。6.权利要求1的方法，其中所述施用包括施用与有效促进穿过细胞膜转运的结构部分连接的SPKC肽拮抗剂。7.权利要求6的方法，其中所述结构部分选自由下列各项组成的组Tat_来源的肽、触角足载体肽，和聚精氨酸肽。8.权利要求6的方法，其中所述肽是KAI-9803。9.权利要求1的方法，其中所述症状包括葡萄糖利用的增加、能量依赖性膜去极化、或大脑代谢速率变化。10.刺激星形胶质细胞活性的方法，其包括向星形胶质细胞群体提供治疗有效量的SPKC抑制肽，由此星形胶质细胞的增殖，相对于未被提供δPKC抑制肽的星形胶质细胞群体而增加。11.权利要求10的方法，其中所述肽包括δPKC的第一可变区的4-25个残基。12.权利要求10的方法，其中所述肽是ΚΑΙ-9803。13.权利要求10的方法，其中所述肽包括δPKC的第五可变区的4-25个残基。14.权利要求10的方法，其中所述施用包括施用与有效促进穿过细胞膜转运的结构部分连接的SPKC肽拮抗剂。15.权利要求14的方法，其中所述结构部分选自由下列各项组成的组Tat-来源的肽，触角足载体肽，和聚精氨酸肽。全文摘要本发明涉及δPKC抑制肽用于治疗脑损伤特别是创伤性脑损伤(TBI)的应用。在一个实施方案中，特异性抑制δPKC的肽用于通过促进星形胶质细胞增殖而保护神经组织。文档编号A01N37/18GK101820756SQ200880111466公开日2010年9月1日申请日期2008年8月27日优先权日2007年8月27日发明者尚英杰申请人:凯制药公司