一种瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌苗的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养等步骤，本发明方法所制备的瘤毛獐牙菜出愈率高，生长周期短，产量大，为其工厂化生产提供研究基础。
【专利说明】一种瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的快繁方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]瘤毛猜牙菜,龙胆科,//ara,又名:当药、紫花。当药为一年生草本植物，主产于中国、朝鲜、俄罗斯，国内广泛见于北方各省，全草均可入药。生于山坡草甸、沟谷溪边草甸，分布于我国河北、甘肃、四川、辽宁、吉林、山东、山西、河南、北京、燕山北部、鄂尔多斯。全草含生物碱、龙胆碱、黄酮类化合物、当药黄酮、异牡荆素、咕吨酮类、维菊叶龙胆酮、当药咕吨酮、甲基当药咕吨酮、甲基雏菊叶龙胆酮、对叶当药咕吨酮及微量去甲基当药咕吨酮。另外，尚含黄色龙胆根素、黄色龙胆根素葡萄糖甙及龙胆苦甙、龙胆蒽醌和齐墩果酸。主治黄疸型肝炎，痢疾，胃痛，消化不良，牙痛，目赤，头痛，口疮；外用治疮肿，目前关于其栽培方法尚无研究。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的繁殖方法，本发明方法所制备的瘤毛獐牙菜出愈率高，生长周期短，产量大，为其工厂化生产提供研究基础。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
取瘤毛獐牙菜种子，清洗干净，在洗衣粉中浸泡25min，流水冲洗2.5h，超净工作台上75%酒精处理lOmin，0.2%氯化汞处理23min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的种子放置与光照培养箱中接入H+NAA0.0lmg/L+6-BA0.3mg/L+ZT0.8mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，温度25°C，诱导出来的愈伤组织接入培养基H+ZT0.5mg/L+KT0.5mg/L中进行愈伤组织增殖培养，附加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照35001x，光照时间12h/d，温度25 °C，增殖后的颜色翠绿，结构均一的愈伤组织，接入H+ZT0.3-0.5mg/L+KT0.3-0.5mg/L培养基中进行悬浮震荡培养，附加30g/L蔗糖，温度25°C，光照35001x，光照时间12h/d,振幅3cm,震动频率100r/min。
[0005]本发明具有细胞增殖率高等特点，生产出来的瘤毛獐牙菜周期短，产量大，污染小，利于大规模种植。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取瘤毛獐牙菜种子，清洗干净，在洗衣粉中浸泡25min，流水冲洗2.5h，超净工作台上75%酒精处理lOmin，0.2%氯化汞处理23min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的种子放置与光照培养箱中接入H+NAA0.0lmg/L+6-BA0.3mg/L+ZT0.8mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，温度25°C，诱导出来的愈伤组织接入培养基H+ZT0.5mg/L+KT0.5mg/L中进行愈伤组织增殖培养，附加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照35001x，光照时间12h/d，温度25°C，增殖后的颜色翠绿，结构均一的愈伤组织，接入H+ZT0.3mg/L+KT0.3mg/L培养基中进行悬浮震荡培养，附加30g/L蔗糖，温度25°C，光照35001x，光照时间12h/d，振幅3cm，震动频率100r/min，悬浮细胞增长率65%。
[0008]实施例2
取瘤毛獐牙菜种子，清洗干净，在洗衣粉中浸泡25min，流水冲洗2.5h，超净工作台上75%酒精处理lOmin，0.2%氯化汞处理23min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的种子放置与光照培养箱中接入H+NAA0.0lmg/L+6-BA0.3mg/L+ZT0.8mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，温度25°C，诱导出来的愈伤组织接入培养基H+ZT0.5mg/L+KT0.5mg/L中进行愈伤组织增殖培养，附加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照35001x，光照时间12h/d，温度25°C，增殖后的颜色翠绿，结构均一的愈伤组织，接入H+ZT0.5mg/L+KT0.5mg/L培养基中进行悬浮震荡培养，附加30g/L蔗糖，温度25°C，光照35001x，光照时间12h/d，振幅3cm，震动频率100r/min，悬浮细胞增长率60%。
[0009]实施例3
取瘤毛獐牙菜种子，清洗干净，在洗衣粉中浸泡25min，流水冲洗2.5h，超净工作台上75%酒精处理lOmin，0.2%氯化汞处理23min，无菌水冲洗5遍，消毒处理过的种子放置与光照培养箱中接入H+NAA0.0lmg/L+6-BA0.3mg/L+ZT0.8mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，温度25°C，诱导出来的愈伤组织接入培养基H+ZT0.5mg/L+KT0.5mg/L中进行愈伤组织增殖培养，附加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照35001x，光照时间12h/d，温度25°C，增殖后的颜色翠绿，结构均一的愈伤组织，接入H+ZT0.3mg/L+KT0.5mg/L培养基中进行悬浮震荡培养，附加30g/L蔗糖，温度25°C，光照35001x，光照时间12h/d，振幅3cm，震动频率100r/min，悬浮细胞增长率65%。
【权利要求】
1.一种瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的快速繁殖方法，包括无菌苗的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养，其主要步骤如下: (1)取瘤毛獐牙菜的种子，进行消毒处理； (2)取步骤(I)消毒处理过的种子放置与光照培养箱中接入H+NAA0.0lmg/L+6-BA0.3mg/L+ZT0.8mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，温度25 0C ； (3)取步骤(2)诱导出来的愈伤组织接入培养基H+ZT0.5mg/L+KT0.5mg/L中进行愈伤组织增殖培养，附加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照35001x，光照时间12h/d，温度25°C ； (4)取步骤(3)诱导出来的颜色翠绿，结构均一的愈伤组织，接入H+ZT0.3-0.5mg/L+KT0.3-0.5mg/L培养基中进行悬浮震荡培养，附加30g/L蔗糖，温度25°C，光照35001x，光照时间12h/d,振幅3cm,震动频率100r/min。
2.按照权利要求1所述的一种瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(I)中所述瘤毛獐牙菜无菌种子的获得为，取瘤毛獐牙菜种子，清洗干净，在洗衣粉中浸泡25min，流水冲洗2.5h，超净工作台上75%酒精处理10min，0.2%氯化汞处理23min,无菌水冲洗5遍。
【文档编号】A01H4/00GK104304015SQ201410540625
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】刘东锋, 杨成东 申请人:南京帝道农业科技有限公司