专利名称：用于改善蛋白质特性的方法
技术领域：
本发明提供了用于改造蛋白质以优化某些目的环境条件下蛋白质性能的方法。在 一些实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化特定环境条件下酶催化活性的方法。在 一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化不利环境条件下酶催化活性和/ 或稳定性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化它们的贮存 稳定性，尤其不利环境条件下的贮存稳定性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供 了用于改变酶(例如金属蛋白酶)的表面净电荷和/或表面电荷分布以获得与初始酶或亲 代酶相比在洗涤剂制剂中显示改良性能和/或稳定性的酶变体的方法。
背景技术：
在其天然环境之外发挥作用的蛋白质的特性往往是次优的。例如，酶(例如蛋白 酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等)经常在一般包括有效成分的复杂组合的衣物洗涤剂中用 于从织物清除污渍。事实上，大部分清洁产品包括表面活性剂系统、漂白剂、助洗剂、抑泡
齐U、悬污齐U、去污齐U、光漂白齐U、柔软齐U、分散齐U、染料转移抑制化合物、研磨齐U、杀菌剂和香 料以及用于清洁的酶。因此，尽管当前洗涤剂的复杂，然而仍存在难以彻底除去的众多污 点，这部分归咎于次优的酶性能。尽管在酶开发方面已有众多研究，然而本领域仍需要用于 为特定用途和环境改造蛋白质的方法。确实地，本领域仍需要迅速和系统地修改其他蛋白 质的静电特性以优化它们在商业应用中性能的方法。尤其，本领域仍需要用于改造工业用 酶以提供了在清洁溶液中改良活性、稳定性和溶解度的方法，所述工业用酶包括但不限于 脂肪酶、淀粉酶、角质酶、甘露聚糖酶、氧化还原酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和其他酶。 发明概述 本发明提供了用于改造蛋白质以优化某些目的环境条件下蛋白质性能的方法。在
一些实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化特定环境条件下酶催化活性的方法。在 一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化不利环境条件下其催化活性和/ 或稳定性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化它们的贮存 稳定性，尤其不利环境条件下的贮存稳定性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供 了用于改变酶(例如金属蛋白酶)的表面净电荷和/或表面电荷分布以获得与初始酶或亲 代酶相比在洗涤剂制剂中显示改良性能和/或稳定性的酶变体的方法。 本发明提供了用于产生改良蛋白质变体的方法，所述方法包括在第一特性的第 一试验和在第二特性的第二试验中测试多种单一替换的蛋白质变体，其中亲代蛋白质的特 性在每个试验中给予值1. O，适宜的第一或第二特性具有大于1. 0的值，并且非常不适宜的 第一或第二特性具有小于约0. 80的值或在一些优选的实施方案中具有小于约0. 60的值； 在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第一特性相关并且与非常不适宜的第二特性不相关的替换；在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第二特性相关并 且与非常不适宜的第一特性不相关的替换；导入来自前述步骤的替换至蛋白质以产生多重 替换的蛋白质变体。在一些实施方案中，所述方法还包括在第一试验和第二试验中测试多 重替换的蛋白质变体，其中改良的蛋白质变体在所述第一和第二试验中均实现大于1.0的 值，或在第一试验中实现大于1. 0的值并且在第二试验中实现0. 8至1. 0的值。在一些其 他实施方案中，所述方法还包括产生改良的蛋白质变体。在一些实施方案中，所述第一和第 二特性是负相关的。在一些额外的实施方案中，适宜的第一或第二特性具有大于约1. 2的 值。在一些其他实施方案中，非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.40的值。在一些 优选的实施方案中，第一特性是稳定性，并且第二特性是洗涤性能。在一些特别优选的实施 方案中，所述稳定性包含在洗涤剂中的稳定性并且洗涤性能包含在洗涤剂中的血_乳_墨 (BMI)洗涤性能。在一些其他优选的实施方案中，所述蛋白质是中性金属蛋白酶。在一些其 他实施方案中，亲代蛋白是中性金属蛋白酶的野生型成熟形式，而在其他实施方案中，该变 体从芽孢杆菌科(Bacillaceae)中性金属蛋白酶衍生，在一些特别优选的实施方案中，该 变体从芽孢杆菌属中性金属蛋白酶衍生。又在额外的实施方案中，在具有5与12之间pH 的粉末或液体洗涤剂组合物中测试洗涤性能。在一些其他实施方案中，在具有碱性PH的冷 水液体洗涤剂中测试洗涤性能。又在额外的实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于 亲代中性金属蛋白酶的0、-l或-2的净电荷改变，而在一些备选实施方案中，所述替换的至 少之一包含相对于亲代中性金属蛋白酶的+1或+2的净电荷改变。不意图使所述步骤限于 上文所列的确切顺序，因为在本发明中使用任何适宜的顺序。在一些优选的实施方案中，相 对于亲代中性金属蛋白酶，改良的蛋白酶变体具有+1或+2的净电荷改变。又在额外的实 施方案中，所述替换位于亲代中性金属蛋白酶中具有大于约50%溶剂可及表面(SAS)的位 置中。仍在其他实施方案中，亲代中性金属蛋白酶中的一个或多个位置是具有大于约65% 溶剂可及表面(SAS)的位置。 本发明提供了用于产生改良蛋白酶变体的方法，所述方法包括在第一特性的第 一试验和在第二特性的第二试验中测试多种单一替换的蛋白酶变体，其中在每个试验中给 予亲代蛋白酶的特性为1. 0的值，适宜的第一或第二特性具有大于1. 0的值，并且非常不适 宜的第一或第二特性具有小于约0. 80的值或在一些优选的实施方案中具有小于约0. 60的 值；在单一替换的蛋白酶变体的至少之一中鉴定与适宜第一特性相关并且与非常不适宜的
第二特性不相关的替换；在单一替换的蛋白酶变体的至少之一中鉴定与适宜第二特性相关 并且与非常不适宜的第一特性不相关的替换；导入来自前述步骤的替换至蛋白酶以产生多
重替换的蛋白酶变体。在一些实施方案中，所述方法还包括测试第一试验和第二试验中多 重替换的蛋白酶变体，其中改良的蛋白酶变体在第一和第二试验中均实现大于1.0的值， 或在第一试验中实现大于1. 0的值并且在第二试验中实现0. 8至1. 0的值。在一些其他实 施方案中，所述方法还包括产生改良的蛋白酶变体。在一些实施方案中，所述第一和第二 特性是负相关的。在一些额外的实施方案中，适宜的第一或第二特性具有大于约1. 2的值。 在一些其他实施方案中，非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0. 40的值。在一些优选 的实施方案中，第一特性是稳定性，并且第二特性是洗涤性能。在一些特别优选的实施方案 中，所述稳定性包含在洗涤剂中的稳定性并且洗涤性能包含在洗涤剂中的血_乳_墨(BMI) 洗涤性能。在一些其他优选的实施方案中，所述蛋白酶是中性金属蛋白酶。在一些其他实施方案中，亲代蛋白酶是中性金属蛋白酶的野生型成熟形式，而在其他实施方案中，该变体从芽孢杆菌科中性金属蛋白酶衍生。在一些特别优选的实施方案中，该变体从芽孢杆菌属中性金属蛋白酶衍生。又在额外的实施方案中，在具有5与12之间pH的粉末或液体洗涤剂组合物中测试洗涤性能。在一些其他实施方案中，在具有碱性pH的冷水液体洗涤剂中测试洗涤性能。又在额外的实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代中性金属蛋白酶的0、_1或-2的净电荷改变，而在一些备选实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代中性金属蛋白酶的+l或+2的净电荷改变。不意图使所述步骤限于上文所列的确切顺序，因为在本发明中使用任何适宜的顺序。在一些优选的实施方案中，相对于亲代中性金属蛋白酶，改良的蛋白酶变体具有+l或+2的净电荷改变。又在额外的实施方案中，所述替换位于亲代中性金属蛋白酶中具有大于约50%溶剂可及表面(SAS)的位置中。仍在其他实施方案中，亲代中性金属蛋白酶中的一个或多个位置是具有大于约65%溶剂可及表面(SAS)的位置。本发明也提供了使用本文中所述方法产生的多重替换的蛋白质。在一些优选的实施方案中，本发明提供了通过本文所述方法产生的中性金属蛋白酶变体。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供了蛋白酶变体，该蛋白酶变体在与SEQ ID N0:3所示的芽孢杆菌中性金属蛋白酶的残基位置83对应的残基位置处包含替换。在一些其他优选的实施方案中，所述替换包含L83K替换。还提供了 NprE变体，该变体包含选自由i) 4K-45K-50R-54K-59K-90K-129I-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-244S-265P-269H-285R-296E ;45K-50R-59K-90K-1291-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-244S-265P-285R ;45K-59K-90K-1291-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-265P-285R ;和59K-90K-1291-179P-190L-199E-214Q-220E-265P-285R组成的组中的替换组合。 本发明也提供了编码本文所述蛋白酶变体的分离的多核苷酸。此外，本发明提供了包含与启动子有效组合的本文所述多核苷酸的表达载体。本发明中也提供了用本文提供的表达载体所转化的宿主细胞。本发明也提供了清洁组合物，其包含使用本发明方法产生的蛋白酶变体。 本发明提供了用于产生改良的蛋白质变体的方法，所述方法包括a)在第一特性的第一试验和在第二特性的第二试验中测试多种单一替换的蛋白质变体，其中亲代蛋白质的特性在每个试验中给予值1. O，适宜的第一或第二特性具有大于1. 0的值，并且非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0. 80的值；b)在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第一特性相关并且与非常不适宜的第二特性不相关的替换；c)在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第二特性相关并且与非常不适宜的第一特性不相关的替换；和d)导入来自步骤b的替换和来自步骤c的替换至蛋白质以产生多重替换的蛋白质变体。在一些实施方案中，所述方法还包括步骤e)在第一试验和第二试验中测试多重替换的蛋白质变体，其中改良的蛋白质变体在第一和第二试验中均实现大于1.0的值，或在第一试验中实现大于1. 0的值并且在第二试验中实现0. 8至1. 0的值。 在一些实施方案中，蛋白质是选自由蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、氧化酶、转移酶、过氧化氢酶和碱性蛋白酶(alkalase)组成的组中的酶。在一些优选的实施方案中，该酶是蛋白酶或淀粉酶。在一些实施方案中，第一和所述第二目的特性包含选自底物结合作用、酶抑制、表达、洗涤剂中稳定性、热稳定性、反应速率、反应程度、热活性、淀粉液化、生物质降解、糖化作用、酯水解、酶漂白、洗涤性能和纺织
6品修饰作用的两种或多种特性。在一些特别优选的实施方案中，所述方法还包括产生改良的蛋白质变体。在一些实施方案中，所述第一和第二特性是负相关的。在本发明的一些实施方案中，适宜的第一或第二特性具有大于约1. 2的值，和/或非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0.60的值。在一些优选的实施方案中，第一特性是稳定性，并且第二特性是洗涤性能。在这些实施方案的亚类中，稳定性包含在洗涤剂中的稳定性并且洗涤性能包含在洗涤剂中的血-乳-墨(BMI)洗涤性能。在一些实施方案中，第一特性是蛋白质表达，并且第二特性是酶活性。在这些实施方案的亚类中，酶活性包含在洗涤剂中的稻淀粉洗涤性能。在一些优选的实施方案中，蛋白酶选自由中性金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和枯草蛋白酶组成的组。在这些实施方案的亚类中，中性金属蛋白酶是芽孢杆菌科的中性金属蛋白酶。在一些示例性实施方案中，中性金属蛋白酶来自芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)NprE)。在其他实施方案中，淀粉酶是芽孢杆菌科的a淀粉酶。在一些示例性实施方案中，该a淀粉酶来自芽孢杆菌属(例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)Amys)。在一些优选的实施方案中，在具有5与12之间pH的粉末或液体洗涤剂组合物中和/或在具有碱性pH的冷水液体洗涤剂中测试洗涤性能。在一些实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的0、 -1或-2的净电荷改变。在一些实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的+1或+2的净电荷改变。在一些优选的实施方案中，所述替换的至少之一包含至少两个替换，第一替换具有相对于亲代酶的0、-l或-2的净电荷改变；并且第二替换具有相对于亲代酶的+1或+2的净电荷改变。在一些实施方案中，所述至少一个替换包含从1至20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个替换。在一些实施方案中，相对于亲代酶，改良的酶变体具有-2、-l、0、+l或+2的净电荷改变。在一些实施方案中，所述替换位于亲代酶中具有大于约25%、大于约50%或大于约65%溶剂可及表面(SAS)的位置内。本发明也提供了编码本文所述酶变体的分离的多核苷酸。在其他实施方案中，本发明提供了包含与启动子有效组合的该多核苷酸的表达载体。在一些实施方案中，提供了包含该表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了包含使用本发明方法产生的酶变体的清洁组合物。 本发明提供了用于产生改良蛋白质变体的方法，所述方法以可操作的顺序包括a)在第一特性的第一试验和在第二特性的第二试验中测试多种单一替换的蛋白质变体，其中亲代蛋白质的特性在每个试验中给予值1. O，适宜的第一或第二特性具有大于1. 0的值，并且非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0. 80的值；b)在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第一特性相关并且与非常不适宜的第二特性不相关的替换；c)在单一替换的蛋白质变体的至少之一中鉴定与适宜第二特性相关并且与非常不适宜的第一特性不相关的替换；和d)导入来自步骤b的替换和来自步骤c的替换至蛋白质以产生多重替换的蛋白质变体，其中所述多重替换的蛋白质变体是改良的蛋白质变体。在一些优选的实施方案中，所述方法还包括步骤e)在第一试验和第二试验中测试多重替换的蛋白质变体，其中改良的蛋白质变体在第一和第二试验中均实现大于1.0的值，或在第一试验中实现大于1. 0的值并且在第二试验中实现O. 8至1. 0的值。在一些额外的实施方案中，亲代蛋白是酶并且其中改良的蛋白质变体是酶。在一些额外的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角质酶、果胶酶、氧化酶、转移酶和过氧化氢酶。在一些特别优选的实施方案中，该酶是蛋白酶或淀粉酶。在一些额外的实施方案中，第一和所述
7第二目的特性包含由底物结合作用、酶抑制、表达、洗涤剂中稳定性、热稳定性、反应速率、 反应程度、热活性、淀粉液化、生物质降解、糖化作用、酯水解、酶漂白、洗涤性能和纺织品修 饰作用组成的组中的两种或多种特性。仍在一些额外的实施方案中，所述方法还包括产生 改良的蛋白质变体的步骤。在一些额外的实施方案中，所述第一和第二特性是负相关的。 在一些特别优选的实施方案中，适宜的第一或第二特性具有大于约1. 2的值。在一些额外 优选的实施方案中，非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0. 60的值。仍在一些额外的 实施方案中，非常不适宜的第一或第二特性具有小于约0. 40的值。在一些优选的实施方案 中，第一特性是稳定性，并且第二特性是洗涤性能。在一些特别优选的实施方案中，所述稳 定性包含在洗涤剂组合物中的稳定性并且洗涤性能包含血-乳-墨(BMI)洗涤性能。仍在 一些其他实施方案中，在包含约5与约12之间pH的粉末或液体洗涤剂组合物中测试洗涤 性能。在一些额外优选的实施方案中，在包含碱性pH的冷水液体洗涤剂中测试洗涤性能。 在一些其他实施方案中，第一特性是蛋白质表达，并且第二特性是酶活性。在一些额外的实 施方案中，蛋白酶选自中性金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。在一些特别优选的实施方案中，该 丝氨酸蛋白酶是枯草蛋白酶。在一些其他实施方案中，中性金属蛋白酶是从芽孢杆菌科成 员获得的中性金属蛋白酶。在一些备选实施方案中，淀粉酶是从芽孢杆菌科成员获得的a 淀粉酶。在一些其他实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的0、 -1或-2的 净电荷改变。在一些备选实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的+l或+2 的净电荷改变。仍在一些其他实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代酶的0、-1 或-2的净电荷改变。在一些额外备选的实施方案中，所述替换的至少之一包含相对于亲代 酶的+l或+2的净电荷改变。仍在一些其他实施方案中，相对于亲代酶，改良的酶变体具有 +1或+2的净电荷改变。在一些备选的实施方案中，所述替换位于亲代酶中具有大于约25% 溶剂可及表面(SAS)的位置内。在一些优选的实施方案中，所述替换位于亲代酶中具有大 于约50%或大于约65%溶剂可及表面(SAS)的位置内。在一些特别优选的实施方案中，亲 代酶是野生型酶。 本发明也提供了清洁组合物，其包含根据本文所述方法产生的改良的蛋白质变 体。 本发明也提供了分离的中性金属蛋白酶变体，其具有包含至少一个氨基酸替换的 氨基酸序列，所述的氨基酸替换在与包含SEQ ID N0:3中所述氨基酸序列的中性金属蛋白 酶的位置等同的位置处产生。在一些优选的实施方案中，至少一个氨基酸替换在与SEQ ID NO :3中所述氨基酸序列的第83位置等同的位置处产生。在一些特别优选的实施方案中， 该替换是L83K。
附图简述
图1A显示AmyS-S242Q组合电荷文库(CCL)的BODIPY-淀粉水解的相对比活性与 振荡管表达。 图1B显示AmyS-S242Q CCL在TIDE 2x中的稻淀粉微量样品清洁的相对活性与振 荡管表达。 图2A显示AmyS-S242Q CCL的相对振荡管表达与相对净电荷变化。 图2B显示AmyS-S242Q CCL的B0DIPY淀粉水解的相对比活性与相对净电荷变化。 图3A显示AmyS-S242Q CCL的相对振荡管表达与相对净电荷变化。
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图3B显示AmyS-S242Q CCL的稻淀粉微量样品清洁活性与相对净电荷变化。
发明概述 本发明提供了用于改造蛋白质以优化某些目的环境条件下蛋白质性能的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化特定环境条件下酶催化活性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化不利环境条件下其催化活性和/或稳定性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改造酶以优化它们的贮存稳定性，尤其不利环境条件下的贮存稳定性的方法。在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于改变酶(例如金属蛋白酶)的表面净电荷和/或表面电荷分布以获得与初始酶或亲代酶相比在洗涤剂制剂中显示改良性能和/或稳定性的酶变体的方法。
枯草蛋白酶是衣物洗涤剂中使用的主要酶并且可能是世界上使用最广泛的酶。已经指出表面静电效应能调节枯草蛋白酶的催化活性(见例如Russell和Fersht， Nature328:496-500 [1987])。最近，观察到涉及改变枯草蛋白酶净电荷的突变对洗涤剂中的洗涤性能产生巨大影响(见例如欧洲专利号0 479 870 Bl)。认为这种有益效应是因枯草蛋白酶pl(等电点)向洗液pH方向改变所致。然而，稍后的工作证实这个结论并不总是适用(见例如美国专利号6，673，590 Bl)。如该专利中所示，枯草蛋白酶中电荷突变的作用明显取决于洗涤剂浓度，即降低亲代枯草蛋白酶pl的突变提供在低洗涤剂浓度上更有效的酶而升高亲代枯草蛋白酶pl的突变产生在高洗涤剂浓度上更有效的酶。这是极有用的，因为洗液中的洗涤剂浓度在全球范围内变化很大。因此，本领域技术人员显而易见的是，对于枯草蛋白酶洗涤性能的最适Pl ，其取决于洗液中的PH和洗涤剂浓度。此外，已经描述了改善衣物洗涤剂中枯草蛋白酶活性的其他工作(见美国专利
发明者A·肖, J·T·小凯利斯, L·G·卡斯康-佩雷拉, W·埃赫勒 申请人:丹尼斯科美国公司