擁痕或溯死或死亡:4分。如图6所 示，PBS对照组(安慰剂对照）呈现典型的疾病进程，动物临床症状没有显著减轻。而重组间 充质干细胞归巢到MS小鼠脊髓中的数量显著多于实验对照组。说明重组间充质干细胞对疾 病的抑制作用比对照组的间充质干细胞更加显著。（其中PBS对照组与实验对照组的间充质 干细胞比较的P值<0.05，而PBS对照组与实验组重组间充质干细胞比较的P值<0.01)。
[0094] (2)重组间充质干细胞体内抑制炎症，促进髓銷修复与再生作用:干细胞移植4周 后，取各组小鼠脊髓，制成冰冻切片采用，免疫巧光染色剂CD45单克隆抗体巧光染色细胞， 检测脊髓炎症细胞浸润程度，计算炎症面积占脊髓白质总面积的比例。结果如图7所示，其 中WT为正常小鼠对照组，其脊髓没有炎症损伤。相对于PBS安慰剂组，未转染的间充质干细 胞可W减少EAE小鼠的炎症程度。而PSGkl/^eX/比-10转染得到的重组间充质干细胞更进 一步减轻脊髓的炎症损伤程度。
[00M] (3化AE小鼠在免疫14天后分别接受移植PBS(安慰剂组）、未转染的间充质干细胞 (实验对照组)或者PS化-1/SLeX/IL-lO转染得到的重组间充质干细胞(实验组），3周后，取 小鼠的脊髓(L3-L5)，固定后用Lxuol速蓝(LFB)染色检测EAE小鼠脊髓的脱髓銷程度，并计 算脱髓銷面积占脊髓白质总面积的比例。如图8所示，其中WT为正常小鼠对照组，其脊髓没 有脱髓銷损伤。相对于PBS安慰剂组，未转染的间充质干细胞可W减少EAE小鼠脱髓銷面积。 而PSGkl/^eX/比-10转染得到的重组间充质干细胞更进一步减轻脊髓的脱髓銷程度。 [0096] W上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详 细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发 明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种重组间充质干细胞，其特征在于，所述重组间充质干细胞中转染了第一信使 RNA、第二信使RNA和第三信使RNA; 所述第一信使RNA用于表达P选择素糖蛋白配体-1，所述第二信使RNA用于表达唾液酸 化路易斯寡糖-X抗原，所述第三信使RNA用于表达白介素-10。2. 根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于，所述第一信使RNA的基因序 列包括：（a)、SEQ ID No.l所示的核苷酸序列；（b)、与SEQID No.l所示的核苷酸序列具有至 少98%同源性的核苷酸序列；或（c)、SEQID No. 1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基 被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。3. 根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于，所述第二信使RNA的基因序 列包括：（a)、SEQIDN 0.2所示的核苷酸序列；（b)、与SEQIDN0.2所示的核苷酸序列具有至 少98%同源性的核苷酸序列；或（c)、SEQID No.2所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基 被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。4. 根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于，所述第三信使RNA的基因序 列包括：（a)、SEQIDN 0.3所示的核苷酸序列；（b)、与SEQIDN0.3所示的核苷酸序列具有至 少98%同源性的核苷酸序列；或（c)、SEQID No.3所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基 被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。5. -种重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 提供第一信使RNA、第二信使RNA和第三信使RNA，所述第一信使RNA用于表达P选择素糖 蛋白配体-1，所述第二信使RNA用于表达唾液酸化路易斯寡糖-X抗原，所述第三信使RNA用 于表达白介素-10; 提供间充质干细胞，所述间充质干细胞培养在细胞培养液中；以及 将转染试剂、所述第一信使RNA、所述第二信使RNA和所述第三信使RNA加入所述培养所 述间充质干细胞的所述细胞培养液中进行基因转染，得到所述重组间充质干细胞。6. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，还包括在进行所 述基因转染之前〇.5h~2h，更换培养所述间充质干细胞的细胞培养液。7. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，还包括在进行所 述基因转染之前，提供减血清细胞培养液，将所述第一信使RNA、所述第二信使RNA和所述第 三信使RNA与所述减血清细胞培养液混匀； 所述第一信使RNA与所述减血清细胞培养液的质量体积比为O.O1μg/μL~1μg/μL，所述 第二信使RNA与所述减血清细胞培养液的质量体积比为O.O1μg/μL~1μg/μL，所述第三信使 RNA与所述减血清细胞培养液的质量体积比为0.0 1μg/μL~1μg/μL。8. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述第一信使 RNA的加入量与所述间充质干细胞的细胞密度的比值为O.Olyg/cm2~lyg/cm2,所述第二信 使RNA的加入量与所述间充质干细胞的细胞密度的比值为O.Olyg/cm 2~lyg/cm2,所述第三 信使RNA的加入量与所述间充质干细胞的细胞密度的比值为O.Olyg/cm 2~lyg/cm2。9. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，还包括在进行所 述基因转染之前，将所述转染试剂、所述第一信使RNA、所述第二信使RNA和所述第三信使 RNA混勾，静置lOmin~30min。10. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述转染试剂 为RNAiMAX转染试剂。11. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述第一信使 RNA与所述转染试剂的质量体积比为O.1μg/μL~1μg/μL，所述第二信使RNA与所述转染试剂 的质量体积比为〇. 1μg/μL~1μg/μL，所述第三信使RNA与所述转染试剂的质量体积比为0.1 yg/yL~1μg/μLo12. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，还包括在进行 所述基因转染之后，将所述转染了所述第一信使RNA、所述第二信使RNA和所述第三信使RNA 的间充质干细胞培养2h~6h，移除细胞上清液，再加入新鲜的细胞培养液进行细胞培养。13. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，还包括在进行 所述基因转染之后，检测所述P选择素糖蛋白配体-1、所述唾液酸化路易斯寡糖-X抗原以及 所述白介素-10的表达含量。14. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述第一信使 RNA的基因序列包括：（a)、SEQ ID No.l所示的核苷酸序列；（b)、与SEQ ID No.l所示的核苷 酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列；或(c)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其中一 个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。15. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述第二信使 RNA的基因序列包括：（a)、SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；（b)、与SEQIDNo.2所示的核苷 酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列；或(c)、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，其中一 个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。16. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述第三信使 RNA的基因序列包括：（a)、SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；（b)、与SEQIDNo.3所示的核苷 酸序列具有至少98%同源性的核苷酸序列；或(c)、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，其中一 个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。17. 根据权利要求5所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述间充质干 细胞为人骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞。18. -种药物的靶向载体，其特征在于，所述靶向载体中包括权利要求1~5中任一项所 述的重组间充质干细胞。
【专利摘要】本发明公开了重组间充质干细胞及其制备方法。通过在间充质干细胞中转染用于表达P选择素糖蛋白配体-1的第一信使RNA、用于表达唾液酸化路易斯寡糖-X抗原的第二信使RNA和用于表达白介素-10的第三信使RNA，得到重组间充质干细胞。
【IPC分类】A61P37/02, A61P3/00, A61K38/20, A61P29/00, A61K47/48, C12N5/10, A61K35/28, A61K48/00
【公开号】CN105671000
【申请号】CN201610119603
【发明人】曾宪卓
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月2日