一种茶树花原生质体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物技术领域，具体设及一种茶树花原生质体及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 茶叶是中国乃至世界的主要饮料，其之所W能成为中国人千百年W来筛选出来的 主要饮品，成为生活屯件事之一，是因为茶叶中含有多种功能成分，可W促进人体代谢活 力、提高免疫力、生津活血、凝神静思，现代科学又发现其具有抗癌、抗炎、降血糖、降血脂等 诸多功效。茶叶具有如此之多的功效物质，但目前对其研究尚浅，运些物质的代谢及其调控 机制仍不明确，运一方面是有由于运些物质是茶叶中特有的物质，没有模式植物可W借鉴， 另一方面，也正是由于该物种的特异性，想要确定某个蛋白基因的功能，没有很好的表达体 系去验证，很多机制由于拟南芥或烟草中没有相关的代谢通路，无法得到验证;而且茶叶是 木本植物，其转基因技术和组培技术的发展也颇具难度，因此，开发茶树原生质体分离和表 达的技术，是一个重要的突破方向。目前有一些木本植物叶子的原生质体分离技术可W借 鉴，如苹果、澄子等，然而茶树的叶子由于纤维素和多酪等含量高，难W得到大量状态好的 原生质体用于后期转化表达实验。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术中做茶树基因功能验证的手段匿乏，提供一种高效 分离茶树花原生质体的方法W及该方法制备得到的茶树花原生质体和该茶树花原生质体 在外源基因的表达应用。
[0004] 本发明人研究发现，与其他植物相比，茶树(Camellia sinensis)的叶子由于高纤 维、高多酪含量，难W获取高质量、大数量的原生质体，茶树花作为废弃资源，具有跟茶叶一 致的遗传背景，而且花的组织比较嫩，容易分离，茶树花的原生质体则能获得很好的分离效 果和表达活性。
[0005] 本发明的茶树花原生质体，是将茶树花置于消化酶液中经酶解消化后得到茶树花 原生质体。
[0006] 优选，所述的消化酶液具体配方为：每10ml含有MES 0.039g、甘露醇1.6g、KCl 0.0149g、纤维素酶0.15g、离析酶0.04g、果胶酶0.01 g和CaCh 0.0148g，余量为水。
[0007] 优选，具体步骤如下：将茶树花弄成细条后，放置于消化酶液中，于黑暗25°C下摇 晃酶解消化得到茶树花原生质体。
[000引本发明还提供了上述茶树花原生质体在将外源基因转入该茶树花原生质体进行 表达的应用。
[0009]本发明通过调整消化酶液配方体系，可W将茶树花100%彻底降解，并获得大量未 破损的茶树花原生质体。同时，外源基因转化茶树花原生质体后得到的表达率可达30% W 上，与模式植物拟南芥中的平均表达水平一致。本发明对今后茶树基因功能验证乃至亚细 胞定位w及代谢产物检测提供了更直接的证据，比在拟南芥和烟草等模式植物中验证更有 针对性;而且，与长达一周W上的农杆菌注射烟草或组培茶苗的瞬时表达实验相比，该方法 所需的设备材料简单，且快速有效，两天即可看到实验结果。而茶树花原生质体的分离也为 其进一步综合利用奠定了一定的基础，还可W对茶树花废弃资源的深加工利用奠定一定的 基础。
【附图说明】：
[0010]图1是在血球计数板上观察的经消化酶液消化分离后的茶树花原生质体，一个个 透明的圆形细胞即为茶树花原生质体。
[oow 图2是在倒置巧光显微镜中观察的经eGFP: :pUC18转化后的茶树花原生质体，图中 A、C是明场，分别是在10倍和20倍的放大倍数下;B、D是对应的GFP通道，其中的亮点是大量 表达了绿色巧光蛋白GFP的茶树花原生质体。
【具体实施方式】
[0012] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[001引实施例1:
[0014] 申请人研究发现，与其他植物相比、并经过一定的条件优化，茶树花的原生质体能 获得很好的分离效果和外源基因表达活性。
[0015] W下对实施例的具体步骤进行说明：
[0016] a)茶树花原生质体的分离纯化：
[0017] 消化酶液配方如表1所示。其中纤维素酶(Cellulase R-10)、离析酶(Macero巧me R-10)、果胶酶(Pectinase Y-23)购自日本YaKult公司。其他试剂购自美国Sigma公司。在加 入化亂之前先55°C热处理去除蛋白酶活性，恢复到室溫后再加入化此。其配制方法是，先 将MES0.039g、甘露醇1.6g、KCl 0.0149g、纤维素酶0.15g、离析酶0.04g、果胶酶O.Olg加入 水中，55°C热处理lOmin后恢复至室溫，再加入化Cl2 0.0148g，然后用水定容至10ml，由此 得到消化酶液，消化酶液配好后，经0.45WI1滤膜过滤W除去未彻底溶解的粉末，转入9cm培 养皿中。然后取10朵茶树花的花瓣，用刀片切成0.1mm的细条后，浸入10ml消化酶液中，在黑 暗25°C下，W转速50巧m摇晃消化化.。
[0018] 表1原生质体消化酶液配方（10ml体系）
[0019]
[0020] b)茶树花原生质体的纯化与转化
[0021] 经化的酶液消化后，茶树花瓣基本上都降解成分散的原生质体，由此得到茶树花 原生质体，此时在此茶树花原生质体中加入10ml的W5溶液(表2)，混匀后经75皿的尼龙网过 滤。滤液经200 X g离屯、2min，吸去上清。沉淀用1ml W5溶液重悬，并在血球计数板下计数后 (图1)，用W5溶液将浓度稀释到2 X 105celIs/ml。将稀释后的茶树花原生质体溶液在冰浴中 放置30min后，吸去上清，再加入同体积的MMg溶液(表2)，使浓度仍为2X105cells/ml，得到 含茶树花原生质体的MMg溶液。
[0022] 取10化1上述含茶树花原生质体的MMg溶液，加入lOul eGFP: :pUC18质粒（即含有 eGFP的pUC 18质粒，在质粒能表达eGFP)和11 Ou 1阳G/化溶液(表2)，混匀后室溫放置15min。 加入440ul W5溶液颠倒混匀，经200Xg离屯、2min后吸去上清，沉淀用50化1 W5溶液稀释后 转移到6孔细胞培养板中，在弱光下培养过夜后，在倒置巧光显微镜下观察表达情况。
[0023] 表2原生质体转化试剂配方
[0024]
[0025] 结果显示，本发明几乎可W100%彻底降解茶树花，获得大量未破损的茶树花原生 质体。而转化茶树花原生质体后得到的表达率可达30% W上（图2,图中A、C是明场，分别是 在10倍和20倍的放大倍数下;B、D是对应的GFP通道，其中的亮点是大量表达了绿色巧光蛋 白GFP的原生质体），与模式植物拟南芥中的平均表达水平一致。本发明对今后茶树基因功 能验证乃至亚细胞定位W及代谢产物检测提供了更直接的证据，比在拟南芥和烟草等模式 植物中验证更有针对性;而且，与长达一周w上的农杆菌注射烟草或组培茶苗的瞬时表达 实验相比，该方法所需的设备材料简单，且快速有效，两天即可看到实验结果。而茶树花原 生质体的分离也为其进一步综合利用奠定了一定的基础。
【主权项】
1. 一种茶树花原生质体的制备方法，其特征在于，是将茶树花置于消化酶液中经酶解 消化后得到茶树花原生质体。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的消化酶液配方为:每10ml含有 MES 0.039g、甘露醇 1.6g、KCl 0.0149g、纤维素酶0.15g、离析酶0.04g、果胶酶O.Olg和 CaCl2 0.0148g，余量为水。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下:将茶树花弄成细条后， 放置于消化酶液中，于黑暗25°C下摇晃酶解消化得到茶树花原生质体。4. 一种按照权利要求1、2或3所述的制备方法制备得到的茶树花原生质体。5. 权利要求4所述的茶树花原生质体在将外源基因转入该茶树花原生质体进行表达的 应用。
【专利摘要】本发明公开了一种茶树花原生质体及其制备方法和应用。是将茶树花置于消化酶液中经酶解消化后得到茶树花原生质体。本发明通过调整消化酶液配方体系，可以将茶树花100％彻底降解，并获得大量未破损的茶树花原生质体。同时，外源基因转化茶树花原生质体后得到的表达率可达30％以上，与模式植物拟南芥中的平均表达水平一致。本发明对今后茶树基因功能验证乃至亚细胞定位以及代谢产物检测提供了更直接的证据，比在拟南芥和烟草等模式植物中验证更有针对性；而且，与长达一周以上的农杆菌注射烟草或组培茶苗的瞬时表达实验相比，该方法所需的设备材料简单，且快速有效，两天即可看到实验结果。
【IPC分类】C12N5/04
【公开号】CN105670985
【申请号】CN201610255637
【发明人】杨子银, 梅鑫, 周瀛, 傅秀敏
【申请人】中国科学院华南植物园
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月22日