联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA、基因敲除载体及其应用
【专利摘要】本发明提供联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA、基因敲除载体及其应用：具体包括选择适合CRISPR?Cas9靶向剪辑的人乳头瘤病毒16型基因和人PD?1基因的sgRNA序列，将其与CRISPR?Cas9核酸酶基因的表达载体转入HPV16+的人宫颈癌细胞、荷HPV16+移植瘤小鼠，可以明显降低HPV16的表达，并抑制肿瘤的生长。本发明制备的基因表达载体方法步骤简单、sgRNA靶向性好、CRISPR?Cas9系统的敲除效率高,并且不仅能够精确靶向剪接高危型HPV16型和PD?1基因，高效降低高危型HPV16型的基因表达，联合应用还能明显抑制肿瘤的生长。
【专利说明】
联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA、基因敲除载体及 其应用
技术领域
[0001 ] 本发明属于基因工程及生物医药领域，涉及CRISPR/Cas9特异性修饰高危型HPV16 及ro-1多个基因靶点的设计方法，通过靶向敲除高危型HPV16的癌基因表达预防人宫颈癌， 并应用联合免疫基因治疗策略获得增强靶向剪接高危型HPV16的癌基因治疗HPV16+小鼠移 植瘤的良好效果。
【背景技术】
[0002] 近年来，基因组编辑工具广泛应用于生物医学领域，而成簇的规律间隔的短回文 重复序列(CRISPR)技术已成为基因组编辑的热点。CRISPR是自然存在于细菌DNA中的序列， 与CRISPR相关(Cas)核酸酶结合，具有指导RNAs保护细菌基因组免受侵入性噬菌体中检测 到的靶向特异性序列攻击的作用。CRISPR/Cas9技术被Nature、Science杂志分别评为2013 年前10位的明星技术之一，并位居2015年科学杂志评选出来的十大发现之首。该项技术将 成为功能基因组学和系统生物学领域中强有力的研究工具。
[0003] 全世界每年有50多万的女性罹患宫颈癌，约26万人死于该病，成为女性患者死亡 的第二位原因。宫颈癌是少数几个致病原因清楚的人类肿瘤之一，高危型人乳头瘤病毒 (HPV)感染与其发生明确相关。HPV是一种极为常见的病毒，高达75%的女性在一生的某一 阶段会感染HPV，大多数感染可通过自发的免疫反应迅速清除，但少部分感染会持续，并成 为宫颈癌以及宫颈上皮内瘤变(CIN)的主要病因。高危型HPV包括HPV-16，HPV-18，HPV-31， HPV-33，HPV-45等类型。大量的流行病学资料显示，HPV16型为目前诱发宫颈癌的高危亚型， 可在50~60%的宫颈癌组织中检测到此型HPV，其E6和E7基因为明确的致癌基因。目前，已 有针对高危型HPV感染的预防性疫苗在发达国家广泛应用，具有预防高危型HPV感染的效 果。但是临床上仍然使用手术和放化疗治疗宫颈癌，其对中晚期宫颈癌患者的治疗效果还 很不理想，而且对解除高危型HPV感染持续存在也还缺乏有效的方法和措施。因此，对人正 常宫颈上皮细胞感染高危型HPV后的病毒清除以及中晚期人宫颈癌治疗都有待于出现新的 特异性药物和新的治疗方法。
[0004] 研究表明，人宫颈癌患者的免疫耐受涉及先天性免疫和获得性免疫两个环节。首 先，参与先天免疫反应的抗原提呈细胞(APC)、巨噬细胞和NK细胞数量下降，其次参与获得 性免疫的Thl/Th2细胞平衡被打破。目前还没有发现十分明确的宫颈癌特异性免疫耐受标 志物，但研究表明，宫颈癌患者外周免疫系统中ro-i显著上调。故可以从肿瘤通用的免疫调 节途径如ro-1/PD-Li共抑制分子入手，将ro-i基因作为人宫颈癌治疗的干预靶点。
[0005] 脂质体是具有良好的生物相容性的传递载体，其表面修饰配体是构建主动靶向脂 质体的重要方式。细胞穿膜肽(TAT)能够穿过与之接触的任何细胞的细胞膜，而对细胞膜没 有损伤，叶酸受体存在于多种人细胞表面，包括人宫颈上皮细胞及宫颈癌细胞，因而可以赢 应用设计的革G向肿瘤细胞给药(如叶酸修饰包裹革E1向HPV 16基因的sgRNA质粒的脂质体)方 式抑制HPV16基因的表达，预防癌症的发生。
[0006] 现在人正常宫颈上皮高危型HPV感染清除和中晚期宫颈癌治疗存在的问题：（1)药 物不能有效清除细胞内感染的高危型HPV; (2)其他方法特异性敲除HPV E6、E7基因的效率 低，降低HPV基因表达效果较差；（3)靶向人宫颈癌的治疗药物很少，效果有限，副作用较明 显；（4)利用多种治疗方法联合治疗宫颈癌的策略需要提高治疗效果。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA、基因敲除载体 及其应用。
[0008] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0009] 联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA，该抑制高危型HPV表达的sgRNA包括在 CRISPR-Cas9特异性修饰人PD-1基因中可特异性靶向人PD-1基因的sgRNA，该sgRNA的序列 如 SEQ.ID.N0.4或 SEQ.ID.N0.5所示。
[0010] 所述抑制高危型HPV表达的sgRNA还包括与所述可特异性靶向人H)-l基因的sgRNA 联用的可特异性靶向高危型HPV16的sgRNA，该sgRNA的序列如SEQ.ID.N0.6、SEQ.ID.N0.7S SEQ.ID.N0.8。
[0011] 联合免疫基因抑制高危型HPV表达的基因敲除载体，该基因敲除载体选自重组质 粒PGL3-U6-PD1 sgl、pGL3-U6-PDl sg2中的一种，pGL3-U6-PDl sgl由序列如SEQ.ID.N0.4 所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-PDl sg2 由序列如SEQ. ID. NO. 5所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获 得，通过连接SEQ. ID. N0.4或SEQ. ID. N0.5所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克隆位 点内，或者，该基因敲除载体为构建于用于表达核酸酶Cas9的质粒基础上的重组质粒，所述 用于表达核酸酶Cas9的质粒的多克隆位点内分别插入有如SEQ.ID.NO.4、SEQ. ID.N0.5所示 序列中的一种或两种以及如SEQ. ID.NO.6、SEQ. ID.NO.7、SEQ. ID.NO.8所示序列中的一种、 两种或二种。
[0012] 联合免疫基因抑制高危型HPV表达的基因敲除载体组合物，该组合物包括PGL3-U6-PD1 质粒，所述pGL3-U6-PDl质粒选自重组质粒pGL3-U6-PDl sgl、pGL3-U6-PDl sg2中一 种或两种，PGL3-U6-PD1 sgl由序列如SEQ. ID.NO.4所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性 化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-roi sg2由序列如SEQ? ID? N0? 5所示的sgRNA的寡 聚核苷酸双链与线性化口613-1]6-8 81?難质粒连接获得，通过连接3￡〇.10.糾.4或 SEQ. 10.从).5所示序列插入至口613-1]6-881?熟质粒的多克隆位点内。
[0013] 所述pGL3-U6-PDl sgl与pGL3-U6-PDl sg2的质量比为（1~2):(1~2)。
[0014] 所述组合物还包括pGL3-U6-HPV16 sg质粒，所述pGL3-U6-HPV16 sg质粒选自重组 质粒PGL3-U6-HBV16-P sg、pGL3-U6-HPV-E6 sg、pGL3-U6-HPV16-E7 sg中的一种、两种或三 种，PGL3-U6-HBV16-P sg由序列如SEQ.ID.NO.6所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化 pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-HPV-E6 sg 由序列如SEQ ? ID ? N0 ? 7所示的 sgRNA的寡 聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-HPV-E7 sg由序列如 SEQ. ID. N0.8所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过 连接SEQ. ID.N0.6、SEQ. ID. N0.7或SEQ. ID. N0.8所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克 隆位点内。
[0015] 所述PGL3-U6-HPV16 sg质粒与PGL3-U6-PD1质粒的质量比为（1~3):(1~2);所述 PGL3-U6-HPV16 sg质粒采用pGL3-U6-HPV16-P sg与pGL3-U6-HPV-E6 sg或pGL3-U6-HPV16-E7 sg联用，pGL3-U6-HPV16-P sg与pGL3-U6-HPV-E6 sg或pGL3-U6-HPV16-E7 sg的质量比 为（1 ~2): (1 ~2);或者，所述pGL3-U6-HPV16 sg质粒采用pGL3-U6-HBV16-P sg与pGL3-U6-HPV-E6 sg以及pGL3-U6-HPV16-E7 sg联用，pGL3-U6-HPV16-P sg:pGL3-U6-HPV-E6 sg: PGL3-U6-HPV16-E7 sg的质量比为（1~2): (1~2): (1~2)。
[0016]所述组合物还包括用于表达核酸酶Cas9的质粒，所述用于表达核酸酶Cas9的质 粒:PGL3-U6-HPV16 sg质粒:pGL3-U6-PDl质粒的质量比为（1~4): (1~3): (1~2)，所述用 于表达核酸酶Cas9的质粒:pGL3-U6-PDl质粒的质量比（1~2): (1~2)。
[0017] 上述联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA在制备用于抗HPV16+人宫颈癌高 危型人乳头瘤病毒药物或者治疗人宫颈癌药物中的应用。
[0018] 上述联合免疫基因抑制高危型HPV表达的基因敲除载体或载体组合物在制备用于 抗HPV16+人宫颈癌高危型人乳头瘤病毒药物或者治疗人宫颈癌药物中的应用。
[0019] 本发明的有益效果体现在：
[0020] 本发明提出了适合CRISPR-Cas9靶向剪辑的人ro-1基因的SgRNA序列，其与适合适 合CRISPR-Cas9靶向剪辑的人乳头瘤病毒(HPV)16型基因，可用于构建表达抑制高危型人乳 头瘤病毒16型基因（P、E6、E7)和人H)-l基因的sgRNA质粒载体，共同转入荷HPV16+移植瘤小 鼠体内可以明显降低HPV16的表达，并抑制肿瘤的生长。本发明制备的基因表达载体方法步 骤简单、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系统的敲除效率高。
[0021] 本发明制备的特异性靶向高危型HPV16型和ro-1基因的SgRNA载体，不仅能够精确 靶向剪接高危型HPV16型和ro-1基因，高效降低高危型HPV16型的基因表达，联合应用可以 明显抑制肿瘤的生长，既显示出免疫基因方法治疗恶性肿瘤的优效性，还将成为制备靶向 治疗高危型人乳头瘤病毒16+宫颈癌新型药物的核心成分。
[0022] 本发明可应用CRISPR/Cas9快速、简便、高效、特异性剪接高危型宫颈癌HPV16基因 和人PD-1基因的方法，并为将来采用叶酸与细胞穿膜肽等共修饰包裹靶向HPV16基因的 sgRNA脂质体及其他给药方式奠定了物质基础，展现出可能有效清除人正常宫颈上皮内持 续存在高危型HPV16型，并能解决目前宫颈癌治疗中存在问题的明显优势。本发明具有（1) 概念新，利用CRISPR/Cas9剪辑高危型HPV16抑制其病毒复制，继而预防宫颈癌的发生；（2) 效率高，在体内、外实验可明显降低E6，E7的表达，可以清除高危型HPV的感染，预防肿瘤的 发生，还可抑制肿瘤的生长;（3)多靶点，可以同时敲除修饰多个靶点基因的突出特点。
【附图说明】
[0023]图1为Cas9实现定点切割导致DNA及双链断裂过程示意图；
[0024] 图2为sgRNA/Cas9介导的HPV特异性切割造成HPV16E6(a)、E7(b)表达变化情况；
[0025]图3为MTT比色法检测刺激指数的结果；
[0026] 图4为观察肿瘤及体积的变化的结果；1、对照组；2、单独敲低PD1组;3、单独敲低 HPV16组；4、联合敲低PD1+HPV16组；
[0027] 图5为用流式细胞仪计数小鼠体内CD8+T细胞的变化情况；1、对照组;2、单独敲低 PD1组;3、单独敲低HPV16组;4、联合敲低PD1+HPV16组；
[0028] 图6为载体PgL3-U6-sgRNA的结构；
[0029] 图 7 为载体 pST1374-NLS-flag-cas9_ZF 的结构。
【具体实施方式】
[0030]下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
[0031] 参见图1，CRISPR/Cas9系统对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的， sgRNA决定了 Cas9的靶向性，也决定了 Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR/Cas9技术， 以高危型HPV16+的人宫颈癌细胞和荷HPV16+移植瘤小鼠模型为研究对象，采用靶致病基因 HPV16，以及协同靶向肿瘤免疫调节分子PD-1的基因编辑策略。首先，通过体内外筛选针对 HPV16基因的gRNA序列，实现HPV16基因的有效敲除;然后，通过体内外筛选针对ro-1的gRNA 序列，通过共转染实现多基因协同编辑效应，进而考察联合干预不同靶点的治疗策略是否 对HPV16+小鼠移植瘤治疗具有"1 + 1>2"的协同效应。本发明是采用cas9能够实现多重基因 敲除的优势，采取特异性靶向"单一基因"或"协同作战"的方法，针对疾病的内外因涉及的 主要分子靶点同时进行干预，能够联合发挥被动清除病毒致癌基因和主动免疫的治疗作 用，从而为人宫颈上皮高危型HPV16基因清除和宫颈癌的有效治疗提供新的策略。
[0032] 本发明在直接靶向剪接高危型HPV16基因的基础上，利用CRISPR/Cas9联合特异性 敲除HPV16和人ro-1基因的方法，对小鼠HPV16+的移植瘤实施免疫基因治疗的策略。首先分 别设计和合成特异性靶向HPV16基因的sgRNAl和特异性靶向H)-l基因的sgRNA2,将sgRNAl 和sgRNA2与线性的pGL3-U6-sgRNA质粒连接成pGL3-U6-HPV16 sg质粒和pGL3-U6-PDl质粒。 在验证将PGL3-U6-HPV16 sg质粒和pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒转入HPV16+的Siha细 胞后可以明显抑制HPV16基因表达的基础上，将pGL3-U6-HPV16 sg质粒和pGL3-U6-PDl质粒 联合转入荷HPV16+移植瘤的小鼠体内，获得高效敲除HPV16基因表达并明显抑制移植瘤生 长的效果。
[0033] 一、靶向HPV16的sgRNAl和靶向PD1的sgRNA2寡核苷酸的设计和选择，如无特殊说 明，文中sgRNAl是靶向HPV16的序列；sgRNA2是靶向人H)-l的序列。
[0034] 1、在HPV16基因上选择5 ' -GGN(19)GG的序列，如果没有5 ' -GGN(19)GG的序列，5 ' -GN(20)GG或者5'-N(21)GG也可以。ro-1基因上选择5'-GGN(19)GG的序列，如果没有5'-GGN (19)GG 的序列，5'-GN(20)GG 或者 5'-N(21)GG 也可以。
[0035] 2、sgRNAl在HPV16的靶向位点分别位于HPV16的启动子，E6和E7区域。sgRNA2在人 PD-1基因上的靶点位于基因的外显子，这样更容易引起片段的缺失或移框突变，从而达到 基因完全失活的目的。sgRNA2在人H)-l基因上的靶位点位于不同的各种剪切形式的共有外 显子上。
[0036] 3、在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNAl和sgRNA2的靶序 列是否唯一，减少潜在的脱靶位点。
[0037] 4、如果用针对HPV16不同区域的sgRNAl来实现联合靶向HPV16基因，即可更有效的 敲低HPV基因。
[0038] 5、如果用靶向HPV16不同区域的三个sgRNAl联合靶向人H)-l基因的sgRNA2,能更 有效的抑制小鼠体内荷HPV16+移植瘤的生长。
[0039]二、构建sgRNA的寡聚核苷酸双链
[0040] 根据选择的s gRNA 1 s和s gRNA2 s，在其5 '加上CCGG得到正向寡核苷酸 (Forwardoligo)，如果序列本身在5'端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G;根 据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5'加上AAAC得到反向寡核苷酸 (Reverse oligo);分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷 酸的forward oligo和reverse oligo成对退火。
[0041] 退火反应体系如下： 1|:链0丨匕〇(丨00#，1) 2.5}.iL 负敏 0丨igo(lOOiiM) 2.5j,iL
[0042] ddH2Q 4pL NEB Buflcr ljiL
[0043] 在PCR仪中按照以下touch down程序运行：95°C，5min; 95-85°Cat-2°C/s; 85-25°C at-〇. 1 °C/s；hold at 4°C
[0044] 退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链，序列如下：
[0045] Forward 〇1i go:5'-CCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN
[0046] Reverse oligo:NNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5,〇
[0047] 三、sgRNA寡聚核苷酸质粒的构建
[0048] 1 ?线性化pGL3_U6_sgRNA质粒（如图6所不，Addgene(Cambridge ,MA,USA))酶切体 系和条件如下：2yg pGL3-U6-sgRNA(400ng/yL);lyL CutSmart Buffer ;lyL Bsal (NEB) ?补 水至50yL，37°C孵育3-4小时；酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit(AP-PCR-250)纯化 回收至20-40UL灭菌水中。
[0049] 2.将退火的sgRNAl寡聚核苷酸双链和退火的sgRNA2寡聚核苷酸双链与线性化 pGL3-U6-sgRNA质粒分别连接，获得pGL3-U6-HBV16 sg质粒和pGL3-U6-PDl质粒。
[0050] 3 ?转化大肠杆菌感受态细胞，并涂Amp+平板(50iig/mL)。
[00511 4.用SEQ. ID. NO. 1的通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆。
[0052] 5.37°C摇床摇菌过夜培养阳性克隆并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP_MN-P-250)抽提pGL3-U6-HPV16 sg质粒和pGL3-U6-PDl质粒。
[0053] 四、转染人宫颈癌SiHa(HPV16+)细胞
[0054] 1 ?按Lipofectamine 2000Transfection Reagent(Invitrogen，11668-019)的操 作手册，将分别带有对应HPV16基因的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-HPV16 sg质粒(单独靶 向 HPV16 启动子、E6 或 E7)与 pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF 质粒（结构如图 7 所示，Addgene (Cambridge，MA，USA)混匀，共转染 SiHa 细胞。
[0055] 2.为提高基因敲除效率，在靶向HPV16基因的sgRNA寡核苷酸设计、选择和合成之 后，将靶向HPV16基因的sgRNAl寡聚核苷酸（即靶向HPV启动子、E6或E7的sgRNA)分别与线性 化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得含靶向HPV16启动子，E6和E7的sgRNA寡聚核苷酸的载体 pGL3_U6_HPVl6 sg，按如下操作转染SiHa细胞：按照Lipofectamine 2000Transfection Reagent (Invitrogen, 11668-019)的操作手册，分别将两组(第一组:革E向HPV16启动子区的 sgRNAl-P寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HPV16-P sg(对应的sgRNA为序列表的SEQ.ID.N0.6) 和靶向HPV16 E6区的sgRNAl-E6寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HPV-E6 sg(对应的sgRNA参照 序列表中的SEQ.ID.NO. 7);第二组：靶向HPV16启动子区的sgRNAl-P寡聚核苷酸的载体 PGL3-U6-HPV16-P sg和靶向HPV16 E7区的sgRNAl-E7寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HPV16-E7 sg(对应的sgRNA参照序列表中的SEQ.ID.NO.8)，每组内的两种质粒混合比例按1:1(病人类 型不同，对应的靶点的量也可调整），混合质粒与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒混匀，共 转染SiHa细胞。
[0056] 在转染后二天，提取细胞RNA，用RT-PCR的方法检测E6、E7基因的表达。
[0058] 参见图2,对照组(gRNA empty vector)是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3- U6-HPV16 sg(对应的sgRNA为3￡〇.10.勵.2)，处理组是单独（图2&及图213中￡637)或者联合 加入（图 2a 及图 2b 中 Promoter+E6、Promoter+E7)针对 HPV16 的 sgRNA 载体 pGL3-U6-HPV16 sg。用RT-PCR方法检测单独或者联合sgRNAl转染细胞后，E6，E7基因的表达情况。图2中的 Blank是不加任何质粒的细胞，图2结果表明：相比较空白组和对照组，单独敲除可以有效降 低E6或E7的表达，联合敲除相比较单独敲除有更好的效果。
[0059]五、敲除人H)-l基因，采用MTT比色法检测其刺激指数 [0060] 1.DC细胞的制备和培养
[0061] (1)断颈处死小鼠，浸没在75%酒精消毒5min，无菌条件下分离取出小鼠两股骨和 胫骨，剔除肌肉和筋膜，于75%酒精消毒30s，置于生理盐水中备用；
[0062] (2)用剪刀剪去胫骨和股骨的两端，暴露骨髓管，用10mL针筒吸取生理盐水，分别 插入骨髓两端，冲出骨髓于50mL离心管；
[0063] (3)于1500rpm离心10min，弃上清，沉淀加入2ml红细胞裂解液，吹打均匀作用约 2min，再加入约40mL生理盐水沉淀混匀终止；
[0064] (4)于lOOOrpm离心10min，弃上清，加入新鲜1640培养液5mL，镜下计数细胞量，以 lxl06mL细胞密度种入6孔培养板，每孔2mL;
[0065] (5)置37 °C、5 % C02培养箱培养2h，生理盐水轻轻洗去未贴壁细胞；
[0066] (6)加入1640培养液，并加入1'111611-〇5?(2〇1^/111]^)，1'1111]^-4(2〇1^/11^)，非必需氨基 酸（1:100)，丙酮酸钠（1:100)，FCS(10 % )，每孔约2mL，最后置于培养箱培养，隔天半量换 液。然后分为对照组和转染PD-1-CRISPR/Cas9组（带有对应PD-1的sgRNA寡聚核苷酸的 PGL3-U6-PD1 sg质粒与pST1374-NLS-f Iag-Cas9-ZF质粒混匀）。
[0067] 2. T淋巴细胞分离和纯化
[0068] (1)无菌条件下分离出小鼠脾脏，用生理盐水冲洗干净，用剪刀反复剪碎，经200目 细胞滤器过滤，去掉血管及一些结缔组织，收集细胞悬液至50ml离心管；
[0069] (2)于1500rpm离心15min，弃上清，沉淀加入4ml红细胞裂解液(NH4CI)，吹打均匀 作用约2min，再加入约40mL生理盐水混匀终止；
[0070] (3)于lOOOrpm离心10min，弃上清，重悬于RPMI-1640培养液(含10%FCS)备用；
[0071] (4)尼龙毛用0.2M的HCI侵泡过夜，用双蒸水洗净HCI，烘干后仔细撕开梳整，取约 〇. 3g均匀装入5mL的一次性注射器，高压灭菌；
[0072] (5)用预温至37°C的RPMI-1640培养基润洗尼龙毛3遍，再浸润后置于37°C培养箱 静止lh;
[0073] (6)放出注射器里的液体，立即加入2xl〇VmL细胞悬液(置于含约10%FCS的RPMI 1640培养基中）约2mL，再加约0.5mL含10%FCS的RPMI-1640培养基，置于培养箱静止lh; [0074] (7)收集滤液，速度控制在1滴/S，然后用预温至37°C、含10%FCS的RPMI1640培养 基15-20mL洗柱3遍，收集洗液，同样速度控制在1滴/s;
[0075] (8)收集到的液体于lOOOrpm离心10min，得到的沉淀即为T淋巴细胞，将部分T细胞 冻存，用于后续的实验。
[0076] 3、MTT比色法检测刺激指数
[0077] (1)将上述冻存的T细胞复苏，重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基；
[0078] (2)取步骤（1)培养到第9天的DC细胞，分别用完全RPMI -164培养液悬浮为1 X 106 个/mL，加入丝裂霉素25yg/mL，37°C水浴30min去增殖后，用不完全RPM 1-1640培养液洗涤3 次，再用含10%胎牛血清的1?^1-1640完全培养基悬浮细胞；
[0079] (3)按1:10、1:20、1:50的DC与T细胞比例加入96孔圆底培养板中，终体积为200此， 每组各设3复孔，在37 °C、5 % C02培养箱培养4d;
[0080] (4)培养结束前4h，每孔加入5mg/mL的MTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2 )-2，5-二苯基四 氮唑溴盐）15yL，继续在37 °C、5 % C02培养箱培养；
[0081 ] (5)4h后弃去全部上清（lOOOr Pmin离心5min)，每孔加入DMS0 100此，充分振荡 10min，测定波长490nm的吸光度(A)值，结果以3孔均值表示。
[0082] 参见图3,对照组是与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒共同转入的没有切割活性 的 sgRNA 载体 pGL3-U6-roi sg(对应的 sgRNA 为 SEQ.ID.N0.3，gRNA-empty vector)，处理组 是联合加入针对H)1的sgRNA载体pGL3-U6-roi sgl和pGL3-U6-roi sg2(对应的sgRNA为 SEQ? ID? NO? 4和SEQ? ID ? NO? 5，gRNA-PDl-(sgl+sg2)组，1:1，病人类型不同，对应的靶点的量 也可调整），以及仅加一种针对PD1的sgRNA载体pGL3-U6-PDl sgl(gRNA-PDl-sgl组）或 PGL3-U6-PD1 sg2(gRNA-PDl-sg2组）。在同一靶效比的条件下，CRISPR/Cas9-PD1 组DC刺激T 淋巴细胞增殖的能力明显强于对照组。
[0083] 六、建立小鼠荷HPV16+移植瘤模型，观察联合靶向剪接HPV16和PD1基因抑制肿瘤 的效果
[0084] 1、建立小鼠荷HPV16+移植瘤模型
[0085]培养小鼠TC-1细胞，按每个注射点2X106个细胞的数量接种Balb/c小鼠背部皮 下，总共20只。
[0086] 2、分组体内联合免疫基因治疗实验
[0087] 待移植瘤长至2謹3大小，将其分为分为4组，即对照组、敲低HPV16组、敲低PD1组以 及联合敲低TO1+HPV16组。采用电穿孔注射靶向HPV16和人roi基因质粒的方法，每组给的剂 量分别为对照组：40yg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+20yg空gRNA;敲低HPV16组：40yg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10yg pGL3-U6-HPV16-P sg+lOyg pGL3-U6-HPV16-E6 sg+lOy g PGL3-U6-HPV16-E7 sg;单独敲除人 PD1 组：40yg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10yg PGL3-U6-PD1 sgl + lOyg pGL3-U6-PDl sg2;联合敲低PD1+HPV16组：40辟。51'1374，1^-flag-Cas9-ZF+10ygpGL3-U6-HPV16-Psg+10ygpGL3-U6-HPV16-E6sg+10ygpGL3-U6-HP16V-E7+10yg pGL3-U6-PDl sgl+lOyg pGL3-U6-PDl sg2。
[0088] 3、观察移植瘤生长与HPV16基因表达改变
[0089] 于给药后3d/7d/14d分别用游标卡尺测量抑制瘤大小（3次），计算、观察移植瘤变 化情况，在给药后于22d脱白处死小鼠，称量移植瘤，并测定HPV16E6和E7基因的表达改变。 参见图4，相比较于对照组，单独敲除roi或HPV有很好的效果;联合敲除HH+HPV相比较对照 组和单独敲除组有更好的抑制肿瘤生长的作用。
[0090] 4、测定CD8+T细胞数量变化
[0091]处死小鼠时留取其脾细胞，分离淋巴细胞；调整收集的淋巴细胞密度至3 X106/ mL，取lyg anti-⑶8-FITC对应106细胞，冰浴、避光染色30min后，用流式细胞术测定⑶8+T 细胞数量变化。参见图5,相比较于对照组和单独敲除组，联合敲除PD1+HPV可以显著提高体 内⑶8+T细胞的数量。
【主权项】
1. 联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA，其特征在于：该抑制高危型HPV表达的 sgRNA包括在CRISPR-Cas9特异性修饰人ro-Ι基因中可特异性靶向人ro-Ι基因的sgRNA，该 sgRNA 的序列如 SEQ.ID.NO .4或 SEQ.ID.NO .5所示。2. 如权利要求1所述联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA，其特征在于:所述抑制 高危型HPV表达的sgRNA还包括与所述可特异性靶向人Η)-1基因的sgRNA联用的可特异性靶 向高危型 HPV16 的 sgRNA，该 sgRNA 的序列如 SEQ.ID.N0.6、SEQ.ID.N0.7SSEQ.ID.N0.8。3. 联合免疫基因抑制高危型HPV表达的基因敲除载体，其特征在于:该基因敲除载体选 自重组质粒pGL3-U6-roi sgl、pGL3-U6-PDl sg2中的一种，pGL3-U6-PDl sgl 由序列如 SEQ · ID · N0 · 4所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-PD1 sg2由序列如SEQ. ID. NO. 5所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA 质粒连接获得，通过连接SEQ. ID. NO. 4或SEQ. ID. NO. 5所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒 的多克隆位点内，或者，该基因敲除载体为构建于用于表达核酸酶Cas9的质粒基础上的重 组质粒，所述用于表达核酸酶Cas9的质粒的多克隆位点内分别插入有如SEQ. ID. N0.4、 SEQ·ID·N0·5所示序列中的一种或两种以及如SEQ·ID·N0·6、SEQ·ID·N0·7、SEQ·ID·N0·8所 示序列中的一种、两种或三种。4. 联合免疫基因抑制高危型HPV表达的基因敲除载体组合物，其特征在于:该组合物包 括PGL3-U6-PD1 质粒，所述pGL3-U6-PDl质粒选自重组质粒pGL3-U6-roi sgl、pGL3-U6-PDl sg2中一种或两种，pGL3-U6-rolsgl由序列如SEQ.ID.N0.4所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链 与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-PDlsg2由序列如SEQ · ID · NO · 5所示的 sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过连接SEQ. ID.NO. 4或 SEQ. 10.从).5所示序列插入至?61^3-1]6-881?熟质粒的多克隆位点内。5. 如权利要求4所述联合免疫基因抑制高危型HPV表达的基因敲除载体组合物，其特征 在于：所述PGL3-U6-PD1 sgl与pGL3-U6-PDl sg2的质量比为（1~2):(1~2)。6. 如权利要求4所述联合免疫基因抑制高危型HPV表达的基因敲除载体组合物，其特征 在于：所述组合物还包括pGL3-U6-HPV16sg质粒，所述pGL3-U6-HPV16sg质粒选自重组质粒 PGL3-U6-HBV16-P sg、pGL3-U6-HPV-E6 sg、pGL3-U6-HPV16-E7 sg中的一种、两种或三种， PGL3-U6-HBV16-P sg由序列如SEQ.ID.NO.6所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-HPV-E6sg由序列如SEQ·ID·N0·7所示的sgRNA的寡聚核 苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-HPV-E7 sg由序列如 SEQ. ID. N0.8所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过 连接SEQ. ID.NO. 6、SEQ. ID. N0.7或SEQ. ID. N0.8所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克 隆位点内。7. 如权利要求6所述联合免疫基因抑制高危型HPV表达的基因敲除载体组合物，其特征 在于：所述PGL3-U6-HPV16 sg质粒与pGL3-U6-roi质粒的质量比为（1~3): (1~2);所述 PGL3-U6-HPV16 sg质粒采用pGL3-U6-HPV16-P sg与pGL3-U6-HPV-E6 sg或pGL3-U6-HPV16-E7 sg联用，pGL3-U6-HPV16-P sg与pGL3-U6-HPV-E6 sg或pGL3-U6-HPV16-E7 sg的质量比 为（1 ~2): (1 ~2);或者，所述pGL3-U6-HPV16 sg质粒采用pGL3-U6-HBV16-P sg与pGL3-U6-HPV-E6 sg以及pGL3-U6-HPV16-E7 sg联用，pGL3-U6-HPV16-P sg:pGL3-U6-HPV-E6 sg: PGL3-U6-HPV16-E7 sg的质量比为（1~2): (1~2): (1~2)。8. 如权利要求4或6所述联合免疫基因抑制高危型HPV表达的基因敲除载体组合物，其 特征在于:所述组合物还包括用于表达核酸酶Cas9的质粒，所述用于表达核酸酶Cas9的质 粒:PGL3-U6-HPV16 sg质粒:pGL3-U6-PDl质粒的质量比为（1~4): (1~3): (1~2)，所述用 于表达核酸酶Cas9的质粒:pGL3-U6-PDl质粒的质量比（1~2): (1~2)。9. 如权利要求1或2所述联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA在制备用于抗HPV16 +人宫颈癌高危型人乳头瘤病毒药物或者治疗人宫颈癌药物中的应用。10. 如权利要求4、6或8所述联合免疫基因抑制高危型HPV表达的基因敲除载体组合物 在制备用于抗HPV16+人宫颈癌高危型人乳头瘤病毒药物或者治疗人宫颈癌药物中的应用。
【文档编号】C12N15/85GK105821040SQ201610134003
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月9日
【发明人】甄帅, 李旭, 赵乐, 罗文娟
【申请人】李旭