用于番茄灰霉病菌检测的pcr引物及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及番茄灰霉病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，专用于番茄灰霉病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间番茄灰霉病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
【背景技术】
[0002]由灰葡萄孢ciflerea)侵染引起的番前灰霉病是番前设施栽培中高危害、高损失且影响蔬菜产量、品质、安全的最主要病害之一。该菌可通过侵染番茄植株的叶片、茎杆、花和果实导致番茄灰霉病的发生，病原菌在土壤或病残体上能以菌丝或菌核形式休眠越过冬天或夏天，温湿度适宜时萌发形成大量的分生孢子后凭风雨飞散或借农事操作传播引起番茄植株感病，发病处新生的灰霉分生孢子能够进行重复再侵染，从而导致病情极易扩展和加重。在中国，番茄灰霉病一般年份造成20%左右的减产，严重时超过50%，甚至绝收，该病已在全国各地普通发生，且呈上升趋势，成为当前番茄生产上的重要病害。因此，建立一套快速灵敏的检测方法用于番茄灰霉病的早期诊断，防止其从发病区向未发病区传播，对番茄灰霉病的及时控制具有重要意义。
[0003]自从发现番茄灰霉病菌以来，世界各国研究人员已对其检测技术进行了研究，传统的检测方法是采用选择性培养基从发病组织中分离病原菌，再对这些病原菌的形态特征等进行鉴定，或者利用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员具有丰富的经验，不能满足病害防治中病原菌准确、快速检测的需求，易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发。因此，开发出快速灵敏、易操作、易普及的检测方法对于控制病害具有十分重要的意义。
[0004]随着分子生物学技术的发展，应用聚合酶反应(polymerase chain react1n,PCR)扩增技术对植物病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外已有研究人员利用真菌核糖体转录间隔区ITS (internal transcribed spacer)基因为病原菌检测靶标，开发出了炭疽菌、疫霉菌、枯萎病菌、链格孢等不同病原真菌的特异性检测引物，并利用特异性引物进行PCR扩增，达到病原菌快速、准确的检测和鉴定。本发明通过对灰霉菌属的ITS序列进行比对分析，设计出I对可用于特异性检测番前灰霉病菌的PCR引物，为番茄灰霉病菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地采取防治措施。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术中对番茄灰霉病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，提供了一种用于番茄灰霉病菌特异性检测的PCR引物及其检测方法，利用本发明所述的PCR引物和检测方法检测番茄灰霉病菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。
[0006]实现本发明的目的包括下列步骤(技术方案):
1.通过测定番前灰霉病菌ciflerea)和其它灰霉病菌^acO的核糖体转录间隔区(ITS)基因，对灰霉菌属不同种间ITS基因序列进行比对分析，根据番茄灰霉病菌ITS基因序列的特异位点设计出对番茄灰霉病菌具有特异性扩增作用的I对引物，即特异PCR检测引物的序列为:
上游引物 BCF:5’ - GCTCGCCAGAGAATACCAAA -3’，
下游引物 BCR:5’- CCTACCTGATCCGAGGTCAA -3’ ；
对番茄灰霉病菌特异性扩增出386bp的产物。
[0007]2.番前灰霉病菌特异分子检测方法的建立
(O提取待测样品(带菌的番茄植株组织或土壤等)基因组DNA。
[0008]用于检测番茄植株组织是否存在番茄灰霉病菌时，采用NaOH快速裂解法提取番茄植株组织基因组DNA，具体过程如下:向1.0 mg番茄植株组织(花、叶或果实)中加入0.5mol/L NaOH 30 KL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中，12，000 rpm离心6 min，取上清液5 μ?加入0.1 mol/L Tris-HCl (ρΗ=8.0)495μ?混合均匀，取1.0 μ?作为PCR模板进行扩增；
用于检测土壤中是否存在番茄灰霉病菌时，采用土壤DNA提取法提取土壤中总微生物基因组DNA，具体过程如下:取已过200目筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加入少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500 μ?重量浓度为0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀，12，000 rpm离心15 min,取上清液加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为lOPg/mL蛋白酶K，55°C水浴60min，水浴结束后，加入总体积1/2体积的7.5M NH4AC溶液，上下颠倒混勾，12，000 rpm离心15 min,吸上清液加2倍体积无水乙醇-20°C沉淀20min以上，沉淀结束后，12，000 rpm离心10 min，倾掉上清液，用体积浓度为70%乙醇洗涤沉淀，室温凉干，每份样品所提DNA用20 μ? TE (或无菌超纯水)溶解，取1.0PL作为PCR模板进行扩增。
[0009](2 )以步骤(I)提取的DNA为模板，利用BCF/BCR这一对弓I物进行PCR扩增。PCR反应体系25 μ?，包括2Xrai7 PCR Master Mix (北京天根生化科技有限公司)12.5μ?，10MmoI/L的BCF/BCR引物各1.Ομ?, 1.0 μ? DNA模板，用无菌超纯水补足至25 μ? ;扩增参数为:95 °C预变性5 min, 94 °C变性30 S，60 °C退火45 S，72 °C延伸30 S，共35个循环，最后 72 °C延伸 10 min。
[0010](3)取步骤(2)的PCR扩增产物5.0 μ?用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，4-5V/cm,电泳结束后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约386bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在番茄灰霉病菌，否则所述的检测样品中未存在番茄灰霉病菌。
[0011]本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果:
1.特异性强、准确性高:本发明是根据真菌核糖体转录间隔区(internal transcribedspacer, ITS)序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计了对番茄灰霉病菌具有特异扩增作用的PCR引物，并已经对不同地理来源的番茄灰霉病菌和携带番茄灰霉病菌的样品进行了测试验证，只有番茄灰霉病菌和携带该病菌的样品中能特异性地扩增出一条386bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性。
[0012]2.灵敏度高:病原菌传统的检测方法是通过分离、纯化和形态学鉴定等步骤，这种传统方法的成功需要发病组织中积累到足够量的病原体才能成功。而本发明将设计的特异引物与ITS基因通用引物(ITS1/ITS4)联合起来进行巢式PCR扩增后，对番茄灰霉病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到1fg，比常规PCR检测提高了 10000倍；
3.实用性好:番茄灰霉病菌的快速检测，具有重要的实际应用价值。传统的检测方法一般是在出现症状后，借助其发病症状，对病原菌进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，所需时间较长，给快速而精确地检测病原物增加了难度，由于传统的方法不能在病害发病前期及时进行田间的病原菌动态的监测和检测，时常延误农业生产的防治时机。本发明可对植株和土壤样品中是否存在番茄灰霉病菌进行检测，如果能特异性地扩增出386bp的电泳条带，说明样品中存在该病菌，因此本发明可用于番茄灰霉病显症之前的早期监测，可为确定病害防治最佳时期和制定防治策略的制定提供科学依据，因此本发明具有较好的实用性；
4.操作简便、快速:应用本发明方法，对待测样品基因组DNA进行提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，整个检测过程采用DNA快速提取方法，操作简单，无需对病原菌进行分离培养，大大缩短