一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcAtm1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及植物保护领域中控制真菌致病性的 基因及其编码蛋白质的应用。
【背景技术】
[0002] 灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又称作灰葡萄孢，属于子囊菌门（Ascomycota) 真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树。寄主从苗期、 挂果期到贮存期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的典型症状表 现为"V"形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病害的发生和 蔓延与环境的湿度、温度存在密切的关系，在20°C_23°C，相对湿度90%以上时发生严重。因 此，灰霉病属低温高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，世界上每年因该病 导致的经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分 子研究技术成熟，灰霉病菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。
[0003] 灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包 括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等， 这些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞，并分解死亡的寄主组织作为营养。自然 条件下，灰霉菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常以菌丝体、 分生孢子或菌核附着在植物病残体上，或在土壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵染 来源。当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗，并产生大量的分生孢子。成熟的 分生孢子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低温高湿条件下，分生孢子 萌发形成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主要 从衰败的花器、伤口以及坏死组织侵入。
[0004] 当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形 成的附着胞侵入;伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓 1-4天，此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。灰霉病菌侵入寄主细胞后，将 会直接面临寄主组织内敌对环境的挑战，病原菌必须迅速做出调整，一方面抑制植物的防 御反应，另一方面要积极适应寄主细胞内物理、化学环境，做到这两方面，灰霉病菌才有望 成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通过改变自身的代谢途径，并分泌相关效应因 子(如毒素)来实现上述目标的，但参与相应过程的基因、蛋白及代谢产物及其调控的分子 机制仍所知甚少。对该领域进行深入研究，鉴定灰霉病菌用以适应寄主内环境的关键因子， 不仅有助于揭示灰霉病菌这种死体营养型病原真菌致病的分子机制，还有可能从中发现可 以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理 论和技术基础。
[0005] 灰霉病菌BcAtml是一种ABC膜转运蛋白（ATP-binding cassette transporter)， 其功能尚未获得鉴定，通过分析BcAtml基因的致病功能，评价该基因在灰霉病菌发育及致 病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛选新型杀真菌药剂。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的旨在提供一种控制菌丝生长及致病性的基因及其编码的蛋白质。
[0007] 本发明所提供的控制菌丝生长及致病性基因来源于灰霉病菌，名称为BcAtml，其 DNA序列如SEQ ID No: 1所示。该DNA序列为BcAtml基因开放阅读框，由2203个核苷酸组成， 其中包含2个外显子，分别位于SEQ ID No: 1的5'端第1位至2062位核苷酸之间和第2118位 至2203位核苷酸之间，组成的编码区长度合计为2148个核苷酸。
[0008] 本发明提供了BcAtml基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示，该 序列由715个氨基酸组成。
[0009] 来自灰霉病菌的控制菌丝生长及致病性基因 BcAtml可应用于植物抗灰霉病基因 工程领域。
[0010] 对来自灰霉病菌的控制菌丝生长及致病性基因 BcAtml所编码的蛋白质进行缺失、 突变或修饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。
[0011]本发明证明了BcAtml基因的缺失或突变，导致灰霉病菌致病力显著降低，说明 BcAtml基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达 与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从而有助于开发新 型杀菌剂，即本发明所提供的BcAtml基因的一个重要用途是:该基因的表达与其编码的蛋 白质产物的表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于抗真菌药剂(特别是抗灰 霉病菌药剂)的设计和筛选。
【附图说明】
[0012]图1为BcAtml蛋白质的结构域分析示意图 [0013]其中：Atml为一类ABC膜转运蛋白的保守结构域；
[0014] 图2为灰霉病菌BcAtml基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图
[0015] 其中：WT为野生型菌株B05.10，pAtml-ko为敲除载体，BcAtml-KO为BcAtml基因缺 失突变体，a、b、c、d为用于验证突变体及互补菌株的引物；
[0016]图3为BcAtml基因缺失突变体及遗传互补菌株的PCR验证电泳图
[0017] 其中：a、b、c、d为所用引物，相应位置见图2;M1为BcAtml基因缺失突变体;Ml/Atml 为在突变体Ml基础上转入完整BcAtml基因的互补菌株；
[0018] 图4为BcAtml基因的缺失突变体与野生型菌株B05.10的培养特征对比照片
[0019] 其中:所用培养基为PDA，20°C培养，接种后3天观察拍照；
[0020] 图5为BcAtml基因的缺失突变体与野生型菌株及互补菌株的致病力比较照片
[0021] 其中:所选择寄主为菜豆，采用离体叶片接种孢子的方法。接种3天后进行评价；
[0022] 图6为BcAtml基因的突变体与对照菌株侵染寄主所产生病斑大小的定量分析示意 图
[0023] 其中：接种方法同上，接种3天后对叶片病斑面积进行测量计算，换算成相对大 小。**表示在ρ〈0·01水平上差异显著。
【具体实施方式】
[0024]为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例 中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0025]实施例1 BcAtml基因的相关性分析
[0026] 灰霉病菌BcAtml基因的开放阅读框由2203个核苷酸组成，包含2个外显子，编码区 cDNA全长为2148个核苷酸，编码的蛋白质产物由715个氨基酸组成，结构域分析发现， BcAtml蛋白质包含一个ABC膜转运蛋白的保守结构域Atml (见图1)。
[0027] 实施例2 BcAtml基因的敲除 [0028] 1)敲除载体的构建
[0029] 与Atml-UP-R(5'-TTGGGTACCGAGCTCGAATTC GCTCTGGATAGCACTGCCTTT-3'），以灰霉病菌菌株 B05. 10的基因组DNA为模板扩增BcAtml基因上游871bp片段，采用Atml-DN-F(5'-AAAGATCAAAGGATCGTCGAC GGAGAAGGGTCAAGAACAAGAAG-3')igAtml-DN-R(5'-CTTGCATGCCTGCAGGTCGAC GGAATAGTATAAGCTCCAAGGCAC-3 '）扩增灰霉病菌BcAtml基因下游 683bp片段，反应体系为：10mmol/L dNTP Mixture，0.5yL;10XPCR buffer，2.5yL;上下游 引物各lyL( 10ymo