TGFβ2基因、TGFβ2多肽及它们的应用
【技术领域】
[00011本发明属于生物医学领域，具体地讲，本发明涉及TGF02基因、TGF02多肽及它们的 应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性中发病率最高、危害最严重的恶性肿瘤之一。近年来，随着治疗手段 的更新、治疗方案的改进及治疗方式的多样化，乳腺癌的临床治疗效果得到了很大改善，但 是全世界目前每年仍有约50万人死于乳腺癌。究其原因，乳腺癌是一类分子水平上具有高 度异质性的疾病。在临床、病理组织学形态上相同的肿瘤，其分子遗传学改变并不一定相 似，这些因素影响了其治疗及预后，因此以分子分型差异为依据，进行个体化治疗是未来乳 腺癌治疗的发展方向。
[0003] 肿瘤分子分型最早是在1999年由美国国立癌症研究所提出，通过综合的分子分析 技术使肿瘤的分类基础由形态学转向以分子特征为基础的新的肿瘤分类系统。乳腺癌根据 其不同的分子特征化1?、？1?、册1?2、灯67等状态），一般可分为1^1^11 &1八型化1?、？即日性，册1?2 阴性、Ki67低表达）、Luminal B型(ER、PR阳性，HER2阴性或阳性、Ki67高表达或任何水平）、 HER2过表达型(ER、PR阴性，HER2阳性）、基底样型，其中基底样型乳腺癌约80%均不表达ER、 PR及HER2，也称为"三阴性"乳腺癌（TNBC)。
[0004] 不同的分子分型其治疗方案及愈后也不尽相同。Luminal A型多以内分泌治疗为 主。基于Luminal B型的上述特殊性，患者在内分泌治疗的基础上，有时须接受化疗和抗 HER2靶向治疗。HER2过表达的乳腺癌亚型以靶向治疗和化疗为主。而三阴性乳腺癌（TNBC) 因其缺乏内分泌和靶向治疗的靶点，其对内分泌疗法和HER2靶向疗法均无效，临床治疗上 主要依靠化疗，预后极差，5年生存率不到15%。
[0005] 流行病学资料显示，TNBC好发于年轻女性(年龄〈50岁），其发病较为隐匿，通过乳 腺钼靶首次检出乳腺癌的几率低。与其他亚型的乳腺癌相比，TNBC的远处复发至死亡的中 位间期明显缩短(平均9个月），因此迫切需要寻找TNBC特异性的检测标记物和治疗靶点。
[0006] TGF0是一类功能十分复杂的多肽类细胞因子超家族，家族包括TGFm-i35,其中TGF β?在生理情况下活性最强，但在病理及应激情况下，TGF02可能起着重要作用。TGF0不仅是 一个经典的免疫抑制因子，其在肿瘤的发生发展中也起着重要的作用，在肿瘤发生的早期 TGF0发挥着抑制肿瘤生长的作用，但在晚期又可促进肿瘤的发生。另外TGF0在维持肿瘤干 细胞的特性中也发挥着重要作用，最近多个研究发现肿瘤细胞通过自分泌或者旁分泌TGF0 维持肿瘤干细胞的特性。
[0007] 此外，关于TGF02作为乳腺癌血清学检测标志物未见有报道。
【发明内容】
[0008] 为填充现有技术的空白，本发明的目的是提供TGF02基因、TGF02多肽及它们的应 用，尤其是它们作为检测三阴性乳腺癌血清标志物的应用，为乳腺癌的检测尤其是"三阴 性"乳腺癌检测提供新的靶点，并且为抗肿瘤药物的设计和筛选提供了新的资料。
[0009] 具体的讲，首先，我们利用RT-PCR方法在不同分子分型乳腺癌细胞系中检测TGF02 表达，发现TGF02在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、BT549、Hs578T中表达含量明显高于 Luminal A型MCF7、T47D细胞系，和Luminal B型BT474细胞系，以及HER2过表达型SKBR3细胞 系。
[0010] 此外，我们利用酶联免疫实验检测以上不同分子分型乳腺癌细胞系培养上清中的 TGF02蛋白含量，发现TGF02在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、BT549、Hs578T的培养上清 中的含量明显高于其他分子分型乳腺癌细胞系。
[0011] 进一步，我们通过免疫组织化学对不同分子分型的临床乳腺癌标本检测TGF02表 达，发现TGF02在病理确定为三阴性乳腺癌的标本中表达量高于其他分子分型乳腺癌。 [0012]另外，我通过利用酶联免疫实验对乳腺癌患者血清进行检测，发现TGF02在三阴 性乳腺癌的血清标本中表达量同时也高于其他分子分型乳腺癌患者。
[0013] 因此本发明涉及TGF02基因、TGF02多肽及它们的应用，尤其是它们作为检测三阴 性乳腺癌新的标志物的应用。
[0014] 所述的TGF02基因的序列如SEQ ID N0:1所示；
[0015] 由上述TGFI32基因编码形成的TGFI32多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0016] 它们（TGF02基因和TGF02多肽)作为作为检测三阴性乳腺癌新的血清学标志物的 应用。
[0017 ] 其中三阴性乳腺癌为ER、PR及HER2，所述的ER、PR及HER2均为阴性。
[0018]本发明的有益效果主要体现在：
[0019]以TGF02基因为例，TGF02基因不仅在三阴性乳腺癌细胞系中表达升高，也在三阴 性乳腺癌组织标本和血清中表达较其他分子分型乳腺癌升高。该基因定位于人染色体 lq41，序列全才5966bp，开放读码框1328bp，编码442个氨基酸。本发明的TGFI32基因不仅可 作为目前临床乳腺癌分子分型中三阴性乳腺癌分型的新检测靶点，而且可通过对乳腺癌患 者血清中TGF02进行检测，快速的进行乳腺癌分子分型，优于目前乳腺癌分子分型基于癌组 织标本的免疫组织化学检测方法。以这一基因为靶点，在基因水平上和蛋白水平上设计新 的化学实体，可快速、便捷、有效的进行乳腺癌的分子分型，从而提高乳腺癌治疗的疗效。
【附图说明】
[0020] 图1为TGF02转录本在不同分子分型的乳腺癌细胞系中的表达结果图：在三阴性乳 腺癌细胞系MDA-MB-231、BT549、Hs578T中TGF02在mRNA水平上表达明显高于Luminal A型 MCF7、T47D细胞系，和Luminal B型BT474细胞系，以及HER2过表达型SKBR3细胞系（图中纵坐 标TGF02relative mean expression 中文含义为TGF02的相关表达）。
[0021] 图2为TGF02蛋白（多肽)在不同分子分型的乳腺癌细胞系培养上清中的表达结果 图：在蛋白水平上TGF02在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、BT549、Hs578T中含量明显高于 Luminal A型MCF7、T47D细胞系，和Luminal B型BT474细胞系，以及HER2过表达型SKBR3细 胞系（图中纵坐标TGFf32in culture media的中文含义为TGFI32培养上清中的含量）。
[0022]图3A为TGF02在不同分子分型的乳腺癌标本中表达结果图：
[0023] 图3A:TGFf32的免疫组织化学图，显示TGFI32在三阴性乳腺癌组织标本中表达量高 于Luminal A型、Luminal B和HER2过表达型。
[0024]图4为TGF02在不同分子分型的乳腺癌患者血清中的表达结果图：显示TGF02在三 阴性乳腺癌患者血清中的表达量明显高于正常人、和乳腺癌Luminal A型、Luminal B和 HER2过表达型患者（图中纵坐标TGF02in serum of breast canser patients的中文含义 为TGF02在乳腺癌患者血清中的含量）。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限 于此：
[0026] 实施例1:细胞培养
[0027] 人乳腺癌细胞系MCF7、T47D(Luminal A型），BT474(Luminal B型），
[0028] SKBR3(HER2 过表达型），MDA-MB-231、BT549、Hs578T(TNBC)为广州医科大学肿瘤研 究所保存。细胞均用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养，置于37°C，5 % C02培养箱培养。 [0029]实施例2:实时定量PCR分析TGF02在乳腺癌各细胞系中的表达
[0030] 取生长至对数期的各种培养细胞，TRIZ0L方法提取总RNAdNasel消化后，测量 RNA.以oligdT为引物取等量的RNA按照Fermentas公司Reverse Transcription System程 序逆转录成cDNA。以cDNA为模板，按照SYBGreen操作说明，用以下引物进行实时定量PCR扩 增，TGFI32基因编码区引物：
[0031] SEQ ID NO:3 Forward：5'-TAGACATGCCGCCCTTCTTC-3'
[0032] SEQ ID N0:4 Reverse:5，-CAAGGTACCCACAGAGCACC-3'
[0033]扩增片段为114bp
[0034] GAPDH基因编码区引物：
[0035] SEQ ID NO :5 Forward：5'-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3'
[0036] SEQ ID N0:6 Reverse:5，-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3'
[0037