三角梅BgGA20-OX1基因片段及其干涉重组载体的制作方法
【技术领域】
[00011本发明涉及基因工程技术，尤其涉及一种三角梅BgGA20-0Xl基因片段及其干涉重 组载体。
【背景技术】
[0002] 三角梅原产巴西，19世纪后期引入我国。经过多年的栽培，如今已在我国南方温暖 地区如广东、云南、福建等省广泛种植，成为当地家喻户晓的花卉，深圳、厦门、珠海、三亚、 北海等城市还将其选为市花。三角梅适应性强，易栽培管理，病虫害较少，因而被广泛地应 用于各类庭院与公园绿地等的景观建设。
[0003] 三角梅主要存在枝条徒长的问题，人工修剪的造型常因生长过快，枝条伸出而破 坏，严重降低其观赏价值。同时，频繁修剪还会增加人工成本。
[0004] 赤霉素在植物生长周期中扮演重要的角色，枝条的伸长与赤霉素有着密切的相关 关系。GA20氧化酶是赤霉素生物合成过程的关键酶和限速酶，因此可以通过调节植物体内 GA20-OX基因的表达量来达到控制赤霉素生物合成量的目的，进而控制三角梅的枝条徒长。
[0005] 植物体内存在着保持GA水平稳定的机制，这种机制可以通过GA20-氧化酶基因的 负调节得以实现。GA20氧化酶基因的克隆，使得在分子水平上研究GA20氧化酶的反馈调节 成为可能。目前已在多种植物中分离鉴定出GA20氧化酶基因，随着克隆及转基因技术的不 断发展，GA20氧化酶基因已被转进多种植物体内，并对其生物功能及作用机制进行了研究。 研究表明通过调控GA20氧化酶基因的表达，可以控制植物体内GAs (赤霉素)含量，从而改变 植物生长状况和形态，培育新的植物品种。
[0006] RNAKRNA干扰)指同一基因序列的RNA正义链和其反义链同时表达所形成的双链 RNA可以降解内源靶基因的mRNA，调节和关闭基因的表达，引起基因沉默的现象。RNAi自发 现以来一直是人们研究的热点，利用RNAi技术可以特异性的抑制生物体中目标基因的表 达，从而达到改变生物体性状的目的。RNAi技术作为一种新的技术方法，在各个生物研究领 域内广泛应用并取得了很多重要成果，因此RNAi为大规模高效而复杂的功能基因组学研究 提供了一个便捷的平台，也是植物遗传改良的有力工具
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种三角梅BgGA20-0Xl基因干涉重组载体。
[0008]为实现上述目的，本发明提供一种三角梅BgGA20-0Xl基因片段，其特征在于，所述 基因片段的部分序列如SEQ ID N0:8所示。
[0009] 所述三角梅BgGA20-0Xl基因干涉重组载体为将所述三角梅BgGA20-0Xl基因片段 的干涉序列先后正向和反向克隆入载体质粒pYLRNAi.5所得;所述三角梅BgGA20-0Xl基因 片段的干涉序列为三角梅BgGA20-0Xl基因的一部分序列。
[0010] 所述三角梅BgGA20-0Xl基因片段的干涉序列如SEQ ID N0:9所示。
[0011] 进一步，所述载体质粒为pYLRNAi. 5质粒。
[0012] 所述三角梅BgGA20-0Xl基因干涉重组载体用于控制植物体内的GAs含量，从而改 变植物生长状况和形态的用途。
[0013] 本发明的实施例的结果表明：相对于非转基因组织，转基因组织(含干涉载体未经 过继代的Π 组阳性材料和含干涉载体且经过继代的ΙΠ 组阳性材料）内的GAs含量明显降低， 下降幅度最高可达52.51%;在经过继代后的愈伤组织中，GAs的含量也明显偏低，说明本发 明所述的三角梅BgGA20-0Xl基因干涉重组载体在植物组织体内对GAs的合成起到了明显的 抑制作用，进而对其生长产生了显著的影响。
[0014] 采用本发明的有益效果是：
[0015] l.本发明克隆得到的三角梅BgGA20-0XlcDNA序列（SEQIDN0:10)，可直接应用于 遗传信息的基因分析和特异性引物的设计，进行遗传品种改良的干涉载体构建和基因转化 等。
[0016] 2.根据NCBI(美国国立生物技术信息中心）已知GA20-0X同源基因保守序列设计特 异引物，借助pYLRNAi . 5载体可实现BgGA20-0Xl干涉片段的构建。
[0017] 3.对改良三角梅的株型结构，建立其分子育种平台打下重要基础，并可作为其它 作物株型遗传改良的重要参考依据。
【附图说明】
[0018] 图1是三角梅总RNA电泳图。
[0019]图2三角梅BgGA20_0Xl基因片段扩增电泳图。
[0020] 图3三角梅BgGA20-0Xl基因片段3' RACE序列扩增电泳图。
[0021 ] 图4三角梅BgGA20-0Xl基因片段序列BLAST比对分析图。
[0022]图5三角梅BgGA20-0Xl基因片段氨基酸序列BLAST比对分析图。
[0023]图6是13个GA20-0X1所构建的系统发育树图。
[0024]图7是本发明应用到的干涉载体pYLRNAi . 5的结构图。
[0025]图8是PCR扩增获得干涉正向片段电泳图。
[0026] 图9是pYLRNAi . 5-DNCKX1第一轮重组子菌落PCR检测图。
[0027] 图10是BgGA20-0Xl_RNAi载体第二轮重组子酶切检测图。
[0028] 图11是体式镜下观察愈伤组织⑶S染色结果图。
【具体实施方式】
[0029] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例 中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明 书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0030] 如无特别说明，均为常规方法K参考《分子克隆实验指南》(第三版），科学出版社， 2002，J.萨姆布鲁克等著3
[0031 ] 实施例1:三角梅BgGA20-0Xl基因的克隆
[0032] 1.选择光叶三角梅(B.glabra'Meriol Fitzpatrick'）幼嫩的莖尖或叶片为材料， 用Trizol法提取总RNA(试验结果见附图1)从图中可以看出，其具有980bp左右的条带。 Trizol RNA提取试剂购自英韦创津公司。以下步骤所用RNA逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。
[0033] 2.以三角梅总RNA为模板，采用01igo(dT)18为引物，通过PCR反应获得三角梅cDNA 第一链。
[0034] (1)利用总RNA为模板，采用01 igo (dT) 18为引物，于PCR管中配制反应液：
[0035] 总 RNA 9.5yL
[0036] 01ig〇(dT)18(50ymol/L) lyL〇
[0037] (2)70°C 反应 lOmin，冰浴冷却 2min。
[0038] (3)在冰中向上述管中再加入 5X First-Strand Buffer 4 μ L
[0039] dNTP Mixture (2. 5mmol/L each) 4U：L I?nase: Inhibitor (40U/ y L·)' D. S μ L AMV Reverse Transcriptase (201/μ L) 1 μ L
[0040] Total 2:0 μ U
[0041 ] (4)42°C反应lh，75°C反应15min，冰浴5min，得到三角梅cDNA第一链，-20°c贮存备 用。
[0042] 3.根据NCBI中已登记的GA20-OX同源保守序列，设计简并性引物GA20-OX F(5'_ GTYGTYAACCATGGDGTTGATGC-3'）艮P 为 SEQ ID N0:1 和GA20_ox R(5'_ TCATGTCAGCTCTGTAATGCT-3'）即为SEQ ID N0:2,以上述cDNA为模板进行PCR扩增(试验结果 见附图2)从图中可以看出，扩增得至Ij750bp左右的清晰条带。引物合成由英潍捷基(广州）贸 易有限公司完成。以下反应体系成分购自TaKaRa公司。
[0043] 反应体系如下： Template： 1 μ] WXEX Taq Buffer： 2μL dNTP: mix (2. 5 mmol/L) ： 1:.. 6 .ML
[0044] GA20-QX F (10 Wnol/L)： 0. 8 Hi, GA2Q-OX R (10 IJfflQl/L)； 0. 8 WL EX Taq 酶（2:00?,/μL): 0. 1 μL ddH20： up to 2_L。
[0045] 扩增条件为：
[0046]
[0047] 取5uL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0048] 4.将扩增产物克隆到pMD19-T载体(Takara公司）上，再利用蓝白斑筛选，随机挑取 阳性转化子，接种于含Amp(购自奇华盛生物公司）的LB液体培养基进行筛选，用菌液进行 PCR鉴定，采用通用引物FP1:57 -GTAAAACGACGGCCAGT-3'(见SEQ ID N0:3)和RP1:57 -CAGGAAACAGCTATGAd (见SEQ ID N0:4)，电泳检测到与RT-PCR大小接近的条带。最后经过 基因测序，得到一段731bp的三角梅BgGA20-0Xl基因同源片段序列（见SEQ ID N0:5)。序列 测定由北京六合华大基因科技有限公司完成。SEQ ID NO:5序列如下：
[0049] 5， GATGACTTCTTTGACCAACCCTTGGCTTTAAAGCAAATGGCTCAAAGGAAATTTGGTGAGCATTGTGGCTATGCTAG TAGCTTCACGGGTAGGTTCTCCTCCAAGCTTCCTTGGAAGGAAACTTTGTCTTTTGGCTACTCTCCTAATCACAAGA CCATTGTCCAAGACTACTTCCATAATAGCTTGGGTGACAACTTCGACCACTTGGGGAGGGTGTACCAAGCATATTGT GATGCAATGAGCAAGCTATCATTAGAAATCGCAGAGCTACTTGGGCTAAGCCTTGGTGTGAAGAAACATTATTTCCG AGAGTTCTTTCAAGGCCATGACTCGGTTATGCGGCTCAACTATTATCCACCATGTCAAAGGCCCGATCTTACTCTCG GAACAGGTCCTCAT