TGTGATCCAACATCATTAACCATCCTTCACCAAGATCAAGTTGCTGGTCTTGAAGTGTTTGTT GATGGGAAATGGCGTTCCATTCGCCCTAATTTCAATGCTTTCGTCGTTAACATTGGTGATGCTTTCATGGCTCAATC AAATGGAAGATACAAGAGTTGCTTGCATAGAGCGGTGGTGAATAGCGAGAAACCAAGGAAATCACTAGCATTTTTCT TATGTCCAAACAACAACAAAGTGGTGAAACCACCAAGTGAATTGATAGACAATGAGAATTCAAGGAGATATCCTGAT TTCACATGGCCAATGCTATTGGAATTCACTCAAAAGCA3\
[0050] 5.三角梅BgGA20-0Xl基因片段CDNA3'端序列的克隆
[0051 ] 根据已获得的GA20-0X1基因序列信息（也即SEQ ID N0:5)，利用primer 5在靠近 片段序列的3/端设计特异引物3/R:5/-TCTTGAAGTGTTTGTTGATGGG-3 /(g卩SEQIDN0:6)。根 据S'-Rampid Amplification of cDNA EndsU'-RACE)实验原理，设计下列引物:API :5: GATGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGUhs-S'(即SEQIDN0:7);AP3:5 /-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-SlSPSEQ ID N0:8)。提取总RNA(方法同前），以3'R即SEQ ID N0:6和接头引物API即SEQ ID N0:7进行反转录，并以此产物为模板，以3'即SEQ ID N0:6和 AP3接头引物（即SEQ ID N0:8)进行PCR扩增，得到一段约500bp片段，见附图3。
[0052]根据T-A克隆，将约500bp的扩增产物克隆到pMD19-T载体上。再利用蓝白斑筛选， 随机挑取阳性转化子，接种于含Amp的LB液体培养基进行筛选，用菌液进行PCR鉴定(方法与 前述相同）。电泳检测到与RT-PCR大小接近的条带。经过测序，得到BgGA20-0Xl基因片段3' RACE序列（见SEQ ID N0:9)，具体序列如下：
[0053] 57 TCTTGAAGTGTTTGTTGATGGGAAATGGCGTTCCATTCGCCCTAATTTCAATGCTTTCGTCGTTAACATTGGTGATG CTTTCATGGCTCAATCAAATGGAAGATACAAGAGTTGCTTGCATAGAGCGGTGGTGAATAGCGAGAAACCAAGGAAA TCACTAGCATTTTTCTTATGTCCAAACAACAACAAAGTGGTGAAACCACCAAGTGAATTGATAGACAATGAGAATTC AAGGAGATATCCTGATTTCACATGGCCAATGCTATTGGAATTCACTCAAAAGCACTATAGAGCGGACATGAATACCT TGAATGCCTTCTCACAATGGGTTATTCAACAAACTCATGAAAGAGCTTAATTAAGTTGTGTAAAATGATATATAACT AGGATTATTTTTGGAAGTTATTAGTCCATGCATATTTTATATTTCCTCTTTCTTTCAAGGAAGAAGATATTGATGGA TCGATCGAGTACCATGAAAAAAAAAAAAAA3 7 〇
[0054]根据测序结果，在序列3'末端得到含有poly A序列；由BLASTX比对同源蛋白质，推 测在获得的3'-RACE序列中384bp处的TAG可能为终止密码子。
[0055] 6.三角梅BgGA20-0Xl基因片段序列分析
[0056]根据已有的克隆工作，利用生物软件DNAMAN将得到的所有序列进行拼接分析，获 得了三角梅BgGA20-0Xl基因片段拼接的cDNA序列（见SEQ ID N0:10)。
[0057] 具体序列如下：
[0058] 57 CAGGGTTGATGCCAATTTGATCAAGGACGCCCATGATCTCATGAATGACTTCTTTGACCAACCCTTGGCTTTAAAGC AAATGGCTCAAAGGAAATTTGGTGAGCATTGTGGCTATGCTAGTAGCTTCACGGGTAGGTTCTCCTCCAAGCTTCCT TGGAAGGAAACTTTGTCTTTTGGCTACTCTCCTAATCACAAGACCATTGTCCAAGACTACTTCCATAATAGCTTGGG TGACAACTTCGACCACTTGGGGAGGGTGTACCAAGCATATTGTGATGCAATGAGCAAGCTATCATTAGAAATCGCAG AGCTACTTGGGCTAAGCCTTGGTGTGAAGAAACATTATTTCCGAGAGTTCTTTCAAGGCCATGACTCGGTTATGCGG CTCAACTATTATCCACCATGTCAAAGGCCCGATCTTACTCTCGGAACAGGTCCTCATTGTGATCCAACATCATTAAC CATCCTTCACCAAGATCAAGTTGCTGGTCTTGAAGTGTTTGTTGATGGGAAATGGCGTTCCATTCGCCCTAATTTCA ATGCTTTCGTCGTTAACATTGGTGATGCTTTCATGGCTCAATCAAATGGAAGATACAAGAGTTGCTTGCATAGAGCG GTGGTGAATAGCGAGAAACCAAGGAAATCACTAGCATTTTTCTTATGTCCAAACAACAACAAAGTGGTGAAACCACC AAGTGAATTGATAGACAATGAGAATTCAAGGAGATATCCTGATTTCACATGGCCAATGCTATTGGAATTCACTCAAA AGCACTATAGAGCGGACATGAATACCTTGAAT feCCTTCTCACMTGGGTTl ATTCAACAAACTCATGAAAGAGCTTAATTAAGTTGTGTAAAATGATATATAACTAGGATTATTTTTGGAAGTTATTA GTCCATGCATATTTTATATTTCCTCTTTCTTTCAAGGAAGAAGATATTGAT^ATCXiATCGAGTaCCATl GAAAAAAAAAAAAAA3 7 〇
[0059] 其中，方框部分为引物对应部分；下划线是正向片段目的序列（164bp)即干涉片 段，记为SEQ ID N0:11;具体为：
[0060] GCCTTCTCACAATGGGTTATTCAACAAACTCATGAAAGAGCTTAATTAAGTTGTGTAAAATGATATATAACTAGGAT TATTTTTGGAAGTTATTAGTCCATGCATATTTTATATTTCCTCTTTCTTTCAAGGAAGAAGATATTGATGGATCGAT CGAGTACCATGAAAAAAAAAAAAAA3 〇
[0061] 将序列提交NCBI进行BLAST比对分析，见附图4,结果表明，该序列与Beta ￥11]^31^3(甜菜）的6420-(?丨(^86的1111?祖序列具有80%的相似性，与?38118 871￥31：；^3(欧洲 山毛榉）的GA20-0X1的mRNA序列具有76%的相似性。对其进行氨基酸序列比对分析(见附图 5)，发现其与Beta vulgaris(甜菜）的氨基酸序列同源性达80%，与Dianthus caryophyllus(香石竹)的氨基酸序列同源性达76%，且其氨基酸序列存在与GA底物结合的 保守序列LPW(ET，因此确定此序列为三角梅的GA20氧化酶基因片段，命名为BgGA20-0Xl。由
[0062] BgGA20-0Xl与其他13个GA20-OX所构建的系统发育树（见附图6)分析，三角梅 BgGA2〇-〇Xl 与Dianthus caryophyl lus (香石竹）GA20-0X遗传距离最近，其次是Solanum lycopersicum(番前），然后是Spinacia oleracea(菠菜）。图6为13个GA20-0X 1基因的系统 发育树图，其中EU252106Acacia mangium(马占相思）；NM_0010515490ryza sativa(灿稻）； EF607139Paeonia suffruticosa(牡丹）；U70532Phaseolus vulgaris(菜豆）；U70471Pisum sativum(碗豆）；AB090238Populus alba(银白杨）；HQ833589Pyrus communis(西洋梨）；NM_ 001247434 Solanum lycopersicum(番前）；U33330Spinacia oleracea(菠菜）； AB613267Torenia fournieri (夏堇）；DQ508817Vitis vinif era cultivarCabernet-Sauvignon(葡萄）；NM_001254854Zea mays(玉米）；EU72251 IDianthuscaryophyllus(香石 竹)。
[0063] 实施例2:三角梅BgGA20_0Xl基因干涉重组载体构建
[0064]根据BgGA20-0Xl的基因片段序列和蛋白序列BLAST比对的结果（附图4、图5)，发现 该基因在3'端近200bp的基因序列同源性较低，即序列的特异性较高，因此决定选择该区域 作为正向目的片段用于构建干涉载体。
[0065] 1.选择pYLRNAi.5载体（由刘耀光研究员实验室惠赠，具体方法和描述详见文献： 胡旭霞和刘耀光.，植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用[J].分子植 物育种，2006,4(5) :621-626)作为干涉载体(见附图7)。
[0066] 2.在NCBI上对已知GA20-OX蛋白序列进行BLAST比对，选取与GA20-OX蛋白序列上 较保守的序列，同时对序列酶切位点进行分析，设计特异性引物RNAiFIS' -ACTGGATCCGCCTTCTCACAATGGGTT-37 ( SEQ ID NO : 1 2 ) GTAGAGCTCATGGTACTCGATCGATCdlSEQ ID N0:13)。
[0067] 3.使用上述特异引物，以含有三角梅BgGA20-0XlcDNA片段(实施例1的步骤6所得 即SEQ ID如:8片段）的口]\?)19-1'载体质粒〇31^1^公司购得）为模板，1?嫩丨？1和1?熟丨1?1(即 SEQ ID N0:12和SEQ ID N0:13)为引物扩增RNA干涉载体目的片段，用Agarose Gel DNA