一种用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物防治领域，具体涉及一种用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽抱 杆菌，及含有该解淀粉芽抱杆菌的微生物菌剂，还涉及它们在防治番茄灰霉病i:的用途。
【背景技术】
[0002] 番茄灰霉病是由灰簡萄適菌度ot巧tiscinereaPers.)引起的一种重要病害。该 病害:±1要危害果实，造成果买腐栏i，位危害叶、圣和接1，番茄减产Rj虹2 0 ?."〇~5 0 %,损失严 重。该病原菌寄主范围较广，除侵染茄科蔬菜外，还可侵染瓜类、甘蓝、菜豆.，萬宦、洋葱、苹 果等作物。
[0003] 目前，拇番茄灰霉病的主耍防治方法畜；一是化学防治。化学防治虽有见效決、效 率高等优点，但是因长期使用会造成环境污染、危害害虫的天敌等缺点，因化逐步被淘汰； 其次是生物防治，臣于生物防治药效高、捧效期长、不易产生抗药性、环境友好等优点日益 受到人们的青釀。
[0004] 芽適杆菌優acilliusSP)是一种受到广泛关注的生防细菌，W其分布广、易分 离培养、能产生抗逆性较强的芽抱、肢藏期长和使羯方便等特点，成为--种理想的生防微 生物。因芽抱杆菌能产生内生芽鹽，有极强的抗逆能力，報比其他类型的生防因子，更有 利于菌剤的生产，在剂型加工环境中存活、定殖与繁殖。因此，歸选猜病原菌具有抑朝 作用的芽抱杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。解淀粉芽抱杆菌優acillus a也yloliquefaciens)是羯于防治蓄茄灰霉病的芽抱杆菌之--，目前，用于防治番茄灰霉病 的解淀粉芽抱杆菌主耍有CGMCCNo. 4777 (专利号：ZL201210059785, 0)、BA-KA3 (【申请号】 201410618581. 5)、SZ23(【申请号】201410683826. 2)、LH-1 (专利申请号；201410735508.巧 和NCPSJ17(申请号；2013i0112580.9)等。由于病原菌的多样性和同步迸化，因化需耍不 断-寻找新的雇株防治番茄灰霉病。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种周于防治番茄灰霉病的解淀粉芽抱杆菌菌株，该菌株具 有高效、广谱杀菌活性化点。
[0006] 本发明第二目的在平提供利用上述解淀粉芽抱杆菌生产的微生物菌满。
[0007] 本发明第=目的在于提供上述微生物菌荆的副备方按。
[0008] 本发明第四目的在于提供上述解淀粉芽抱杆菌在防治番茄灰霉病上的用途。
[0009] 本发明第五目的在于提供上述微生物菌韻在防治番茄灰霉病±的用途。
[0010] 本发明第六目的在于提供上述上述解淀粉芽抱杆菌的鉴定方接。
[0011] 本发明第七目的在于提供上述微生物菌剂的鉴定方法。
[0012] 本发明通过於F技术方案实现；
[0013] -一种解淀粒芽抱杆菌（BacillusafflyloHquefaciens)菌樣HMB27633,己于 2015 年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中必（保藏地址为：北京市 朝陶区北辰西路i号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CG版汇No. 11454。 防014] 利用i：述解淀粉芽殖杆菌生产的微生物菌剤，其活性成分为H艦27633菌体。
[0015] ±述微生物菌刻巧臥为液体制满或粉剤。
[0016] ±述徵生物菌剤中1做827633的活菌数大于21. 0X108cfu/mL。
[0017] 上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤；
[0018] (1)菌种活化；蒋低温保存的HMB27633菌株在LB平板培养基上活化；挑取单菌落 在LB斜面培养基上，在巧~3日°0下培养10~16小时，得活化的菌株；
[001引 城种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤（1)活化的菌株接种到100因LLB 液体培养基中，在2日~35。0、转速为150~220rpm条件下培养10~16小时，得种子液；
[0020] 城发酵培养；按照体积比为1~3%的比例将步骤城所得的种子液接入到玉米 粉黄豆粉培养基中，在温度为巧~35'C、转遽为150~22化pm条钟下发醇培养40~50h， 得发酵液；
[0021] (4)检测发酵液中菌体巧芽疆数量，待发薛液中成熟芽疆占到芽抱和菌体总数的 90%时停止发酵培养，所得即为欄827633菌株的液俸副剤。
[0022] ±述制备方法中所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常 规方按制备。
[0023] 述制备方法步骤（1)中所述的LB平板培养基，其组成成分及其重量比为：膜蛋 白朦8~12g,酵母提取物4~6g，氯化钢4~6g，琼脂粉口~18g,水1000阳U
[0024] ±述制备方法步骤（1)中所述的LB斜面培养基，其组成成分及其重量比为：膜蛋 白藤8~12g，酵母提襄物4~6g，氯化链4~6g，琼脂粉12~18g，水lOOOmL。
[002引上述审y备方法步骤巧中所述的LB液体培养基，其组成成分及其重量比为：膜蛋 白腺8~12g，酵母提取物4~6g，氯化链4~6g，水1000陌L，
[0026] ±述制备方接步骤（3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分 比为；玉米粉1.日~3, 0 %，黄岳粉1.日~3, 0%，NaCl0. 1~L0 %，M;iS〇4* &0 0.日~ 1. 0 %，其余为水；pH值为7. 2。
[0027] 所述的玉米粉黄豆粉培养基的靑1|备方法，包括按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、 化C1和MnS〇4 *HgO混合，再加水，媚节pH揽拌巧匀即可。 贿2引 ±述解淀粉芽袍杆菌描旧27633在防治番茄灰霉病上的应周。
[0029] 上述微生物菌剂在防治番茄灰霉病上的应用。
[0030] ±述微生物菌剤的使用方法；将上述所得微生物菌剤用水稀禪至活菌体数为 107c化ZmL，于蓄茄灰霉病发病前迸行叶面喷雾，即可达到预蘭番茄灰霉病发生的目的。
[0031] 1做827633菌株的筛选分离过程
[0032] HMB27633菌栋是河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省雍!州市的棉田上壤 中分离得到。2013年4月河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省嫣州市棉田中五点采 集±；样，混匀后称取Ig放到250血的灭菌H角瓶中，加入lOOmL无菌水，放到摇床上，17化/ min振荡30min，静置化，取上清液lOmL加入50血灭菌离也管中，在80'C恒湿水浴30分钟， 然后取imL加无菌水9mU即成lOmLlO3倍上壤徽生物悬液，继而将上壤悬液稀釋成10 \ 10 5、10 6倩稀釋液，取各浓度微生物悬液200UL涂于LB培养基平板上，每个浓度重复3次， 在30。直温培养Id~3d，进行细菌的分离和纯化。并番茄灰霉病为雖标，通过平板捉時 法、离体叶片法、盆栽试验法进行生防菌的歸选。结果从中筛选化一个对番茄灰霉病具有明 湿防治效果的菌株，足名为陆松27633。
[0033] HMB27633菌株的分类鉴定：
[0034] (1)形;态特征鉴定
[003引在LB培养基__h培养菌体为杆状，培养lOh后产生芽胞，芽廳中生，楠圆形，胞囊不 膨大，抗酸染鱼阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡 乳白色，腺状，圖形，边缘整齐，菌落隆起呈慢头状，表面湿润：培养后期菌落淡黄色，边缘 不整齐，表面平燥有摺皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静记培 养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见翊菌系统鉴定手册》（东秀珠等编著.科学 出版社，2001年）中描述的芽抱杆菌属形态特征基本--致，初步判斷菌株[1陆27633属于芽 袍杆菌。
[0036] (2)利周16S巧NA序列鉴定分类
[0037] 劲MB27633的基因组DNA为模板，F27和R1492为引物对16SrDNA进行PCR 扩增，所述的引物序列为；
[0038] F27 :5,AGAGTTTGATCATGGCTCAG3,；（SEQIDNo:l)
[0039] R1492 ;5,GGCTACCTTGTTACGACTT3';(絕QI日No:2)
[0040] 16SrDNA的扩增反应体系为 50tiL:i0XPCRBuffer舶g2+巧uLsdNTP 齡巧ure任 5 讯曲 5wL;Taq巧[J/uL) 1L，F27 (10u!!ioi/L) 1yL，R1492 (10y也oj_/L) 1uL;HMB27633的基因组D