776bp片段；采用Sep4-DN-F(5' -GGATCCGATGGCGAGATGGTATTTGC-3'） 与S巧4-DN-R(5' -CTGCAGTGCTGAGGCTCCGAGAAGA-3'）扩增灰霉病菌BcSep4 基因下游 63化P 片段，反应体系为：10mm〇l/LdNTPMixUire，0. 5yL;10XPCRbuffer，2. 5yL;上下游引物 各IyL(l〇ymol/mL);模板DNA，1yL!Ex-l'aqtO. 2yU5U) ;(1地2〇，18. 8yL;扩增程序为： 94°C预变性3分钟，然后（I) 94°C，变性50秒；似59°C，退火50秒；做72°C，延伸60秒； (4)循环30次；（5) 72°C延伸10分钟。将上述DNA扩增产物先后克隆至pXEH载体的化O I、EcoRI位点与BamHI、PstI位点，构建成敲除载体pS巧4-ko(如图2所示），并进行测 序验证。 W40]。灰霉病菌的转化 阳041] a.根癌农杆菌的培养
[0042] 挑取含有双元载体pSep4-ko的根癌农杆菌菌株Agl-I单菌落，接种至含50yg/ml 卡那霉素、10yg/ml利福平的MM液体培养基（憐酸氨二钟0. 205%，憐酸二氨钟0. 145%， 氯化钢0. 015 %，屯水硫酸儀0. 05 %，六水氯化巧0.Ol%，屯水硫酸亚铁0. 00025 %，硫酸 锭0. 05%，葡萄糖0. 2% )中，250巧m、28°C振荡培养4她；4000巧m，离屯、5分钟，弃上清， IM液体培养基（憐酸氨二钟0. 205%，憐酸二氨钟0. 145%，氯化钢0. 015%，屯水硫酸 儀0. 05%，六水氯化巧0.Ol%，屯水硫酸亚铁0. 00025%，硫酸锭0. 05%，葡萄糖0. 2%， 200yMS，MES0.854%，甘油0.5% )重悬，4000巧m离屯、5分钟，弃上清；IM培养基重悬， 28°C，250巧m振荡培养化，进行预诱导。
[0043] b.灰霉病菌的产抱培养
[0044] 选用B05. 10菌株，取少量抱子涂布于PDA培养基（马铃馨20%煮烂过滤，葡萄糖 2%，琼脂1. 5% )，置28°C培养化令抱子快速萌发，然后转移至20°C培养3-5天，待菌体表 面被灰色抱子覆盖之后，用IM液体培养基刮取、收集抱子，显微镜观察，利用血球计数器调 节抱子浓度为1Xl〇6/mL。
[0045] C.根癌农杆菌与灰霉病菌分生抱子共培养及转化子筛选
[0046] 将在IM液体培养基中预先诱导化的农杆菌菌液和灰霉病菌抱子液等体积混合， 加入AS,使终浓度达到500yM，混匀，然后按250~350yL/皿，均匀涂抹至铺有玻璃纸的 IM培养基上，22°C黑暗培养4她；共培养完毕后，将玻璃纸转移至含有100yg/mL潮霉素的 PDA培养基上，相同条件下继续培养。4~7天后挑取扩展的菌落到含有同样抗生素的筛选 培养基上。
[0047] 3)缺失突变体的验证 W48] 选用两对引物通过PCR扩增对转化子进行筛选。扩增结果符 合如下结果的确定为BcSep4基因缺失突变体：上游同源臂之外基因组 上的引物a巧'-CTGCTCTAACTCTGCCTCTT-3'）与潮霉素抗性基因的引物 b(5'-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCA-3'）配对可W扩增到预期大小（1. 3化）的重组片段；而编码 区引物C保-TCGAGGAGAACGGCGTAAAG-3'）与d巧' -CAACAACAGCGAATGGGATG-3'）无扩增条 带（野生型菌株可扩增到0. 5化片段）。结果，从转化子中筛选到2株BcSep4基因缺失突 变体：Ml、M2 (如图3所示），用于后续功能分析。
[0049] 4)BcSep4基因缺失突变体的遗传互补
[0050]采用 弓I物C-F(5' -CTGCTCTAACTCTGCCTCTT-3')与 C-R巧' -TGCTGAGGCTCCGAGAAGA-3'），扩增灰霉病菌BcSep4基因全长2793bp(包含启动子、 开放阅读框与终止子），先克隆至pMD18-t载体上，然后再亚克隆至pSULFg巧载体（含有氯 喀横隆抗性基因）的SalI与甜aI位点之间，构建成遗传互补载体pS巧4-ko-c。载体经 测序验证，确认没有氨基酸突变。采用如前所述的农杆菌介导的转化方法，使用IOOyg/mL 氯喀横隆进行筛选，将该互补片段转入BcSep4基因缺失突变体Ml基因组中，获得遗传互补 菌株Ml/Sep4。选用突变体验证时曾使用的引物a与b、C与d进行PCR扩增，结果符合预 期（如图4所示）：与突变体Ml相同，互补菌株Ml/S巧4中原有的BcSep4基因被替换为潮 霉素抗性基因HPH(引物a与b扩增结果为阳性），但额外拥有一个后续转入的BcSep4基因 (编码区引物C与d扩增结果同样为阳性）。
[0051] 实施例3BcSep4基因在灰霉病菌生长发育过程中的作用
[0052] 采用平板培养法，评价BcSep4突变体的生长发育等相关表型的变异情况。将待测 菌株W菌块方式接种在PDA培养基的中屯、，2(TC黑暗培养。突变体的菌落形态及生长速度 正常，与野生型比较没有显著差别；然而，突变体形成菌核的能力显著增强（见图5)。另外， BcSep4基因突变体菌株产抱量显著降低（见图6)。在遗传互补菌株中，上述异常表型均回 复正常，证明BcSep4基因具有促进分生抱子形成、在一定程度上抑制菌核形成的能力。
[0053] 实施例4BcSep4基因在灰霉病菌致病性方面的作用
[0054] 采用离体叶片接种法，评价BcSep4突变体的致病力变化情况。从溫室培养的寄主 植株上采集具有一定叶龄的叶片，水平放置容器中，使用打孔器打取待测菌株菌饼，正面朝 下反扣至叶片上，20°C保湿黑暗培养，3天后评价待测菌株的致病力。实验结果表明，BcSep4 突变体完全丧失了致病能力，不管是接种番茄（见图7)，还是接种油菜（见图8)，BcSep4突 变体均不能引起病害。遗传互补菌株的致病力恢复到野生型水平，运表明，BcSep4是一个 关键的致病基因，是灰霉病菌侵染寄主所必需的。 阳化5] 实施例5BcSep4基因在灰霉病菌侵染结构一一附着胞发育过程中的作用
[0056] 采用玻片培养法，观察BcSep4突变体发育成附着胞的能力。将PDB(马铃馨20% 煮烂过滤，葡萄糖2%)抱子悬浮液巧X104mLi)滴在载玻片上，20°C保湿培养化后，用卢 卡弗巧光增白剂染料染色（该染料可W特异性将细胞壁染上颜色，便于观察）。显微观察 发现，野生型菌株的抱子萌发出的芽管，多弯曲，末端通常膨大，形成侵染结构一一附着胞。 而BcSep4突变体的抱子则基本丧失了发育成附着胞的能力，抱子萌发后迅速直线伸长，末 端难W膨大；将BcSep4基因重新导入突变体，可W将上述异常表型恢复到野生型水平（见 图9)。
[0057] 采用洋葱表皮接种法，观察BcSep4突变体抱子萌发后的侵染能力。用IO4HiL1抱子 悬浮液接种洋葱表皮，20°C解育2地，用乳酪蓝染色后进行显微观察，染不上颜色的为侵染 菌丝。显微观察发现，野生型菌株可W凭借芽管末端形成的附着胞侵入洋葱表皮，而BcSep4 突变体丧失了侵入的能力，抱子萌发后，仅呈现直线生长，无法形成附着胞并侵入表皮；遗 传互补菌株具有正常的侵染能力（见图10)。
[0058]W上研究结果表明，BcSep4基因参与了灰霉病菌侵染结构一一附着胞的形成，并 起到关键作用。
[0059] 实施例6BcSep4基因在灰霉病菌侵染结构一一侵染垫发育过程中的作用
[0060] 采用玻片培养法，观察BcSep4突变体发育成侵染垫的能力。将PDB抱子悬浮液 巧XIO4HiL1)滴在载玻片上，20°C保湿培养36h。显微观察发现，野生型菌株的菌丝体可W 形成大量多分枝垫状结构一一侵染垫，而突变体则完全丧失了发育成运种复杂侵染结构的 能力；将BcSep4基因重新导入突变体，可W恢复其侵染垫发育能力（见图11)。该研究结 果表明，BcSep4基因不但参与了灰霉病菌附着胞的形成，而且在侵染垫发育过程中同样发 挥举足轻重的作用，该基因是灰霉病菌侵染结构发育所必需的，如果该基因或其编码蛋白 质丧失活性，灰霉病菌将失去侵染寄主引发病害的能力。
[0061] 漲化肛No:I的序列 (i) 序列持征：（A)长度：2793bp; (B)类型：核巧酸；（C)链性：单链 (ii) 分子类型；DNA (iii) 序列描述：沈QIDNo:! 1 CTGCTCTAAC TCTGCCTCTT TCTTTGTCTT TCCTTCTGCG GCTCTTGCTT TTCCGGCTTC 61 TATTCTTACT TTCTGCTCAG CTATCTCATC TGCTCTGGCT TCTCTGGCAG CGGCGTTTGC 121 TTCGTCGGCA TTCGTCTTGA ATAAAGTCTT GATCTCTACA TCATTGTTAA CCGGCATCCT 181 CTGATATACC ATGTACGGAA TCTTTACCAG CAACACAATA TGGACATAGT AAATGTGCTC 241 TCTTAATGTG ACCACAAGCA GA(；CATCTGT TCAAGTTCGT AACATCCTGT AATCCTTTGC 301 CTGCCATTTG CCTATGTCTC TTCTTCATGT GTGAAGTCTT CTTCTTTGGC ACGGCCTTCA 361 ATATTCCCTC CCATAGTCC了 TCGA