一种肿瘤分子检测/诊断试剂的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物医药领域，设及一种肿瘤分子检测/诊断试剂，具体地，设及一种 W粪便作为检测样本的肿瘤分子检测/诊断试剂。
【背景技术】
[0002] 目前在结直肠癌筛查上主要有两种常用技术。
[0003] -种是大便隐血试验。通常肠癌的发生演变在早期可W没有任何征兆，癌细胞可 在大肠肠壁上生长数十年再转移到其他部位，在没有任何症状前，增生的组织可渗出少量 血液，血液进入大便被排出。而大便隐血试验就是检测大便中的血液成分(检测对象是血红 蛋白），若多次、持续的阳性反应提示消化道出血，应做进一步检查W警惕肠道肿瘤的发生。 该法的优点是结果显示快、清晰，结果可W半定量。但其存在一系列缺点：首先，其特异性 差，受饮食影响大。含亚铁离子的食物和药物对结果有干扰，假阳性率30%。隐血检查前，指 导患者应避免服用铁剂、动物血、肝类、瘦肉W及大量绿叶蔬菜3天，如有牙銀出血，误咽下 血性唾液，W防粪便隐血检查呈假阳性；其次，其敏感度低，出血量〉9化g/ml才能检出；再 次，该方法学限制条件多：患者提前准备时间长，由于取材部位不同，反应时间不同，对显色 的判断不同，故在同一方法的试验中，也可产生误差，因此一般测试时候均要求患者采用不 同天的粪便样品连续测定。
[0004] 另一种方法是肠镜检查。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效可靠的 诊断方法。绝大多数早期肠癌患者可由内镜检查发现并确诊。它通过肛口插入可检查到直 肠、乙状结肠、降结肠、横结肠、升结肠和盲肠 W及与大肠相连的一小段小肠（回盲末端）。通 过镜子不但可W清楚地发现肠道病变，还可对部分肠道病变进行治疗，如:大肠息肉等良性 病变镜下直接摘除，对肠道出血进行镜下止血，对大肠内异物进行清除。肠镜检查技术是目 前其它诊疗手段无法替代的主要手段。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效可 靠的诊断方法。然而，其也存在一系列的缺点：首先，其需要检查前准备，作肠镜需要在检查 前3天开始进食流质或少渣半流质饮食，检查当天上午空腹，检查前一天开始服用甘露醇等 导泻剂清洁肠道，服用的液体量通常高达化，清洁灌肠 W保证肠道的清洁度，之后不能再进 食。检查时医生会通过肠镜向肠腔内注入一定量气体使肠道膨大便于观察。由于结肠结构 迂回曲折，检查过程中被检查者会有不同程度的胀痛或牵拉感觉。对于过分紧张或高度肠 疫李的受检者，则需要使用镇静剂或解疫药物。对于不能配合的小儿，则需要在麻醉下进 行。其次，其对医生的操作熟练水平有很高的要求，初学者容易在肠镜下遗漏病变部位造成 漏诊。由于检查过程中需要注入气体，会使肠内压力增大，易引起穿孔。再次，病人在检查过 程中费力，费时，有一定的痛苦。并且检查费用高，较难大规模推广。
[0005] 除了上述两种方法之外，分子诊断方法是近年来发展迅速的癌症诊断方法。目前， 已有大量的结直肠癌分子标记物在组织和血液样本中被研究和报道，初步估算已多达130 多种。
[0006] 由于组织取样创伤太大，因此，已有研究着重于粪便样本中的肠癌标记物的筛查。 例如，伍勇等尝试通过检测粪便中的标记物4?0、1(-阿3、953，并进一步结合。081'进行联合诊 断。
[0007] 但由于一方面粪便当中存在多种酶类，会对脱落至粪便中的DNA起到消化、降解作 用，另一方面粪便成分复杂，干扰成分过多，因此，检测结果通常差强人意，对于同一目标基 因，在粪便样本中的检测敏感性和特异性，都远远低于在组织样本中的敏感性和特异性，严 重影响了结果的判断。比如vimentin基因在组织中对结直肠癌的敏感性为83.0%，但在粪 便中的敏感性降为46% (J 化tl Cancer Inst.2005Aug 3;97(15) :1124-32. );SFRP1 和 SFRP2基因在组织中对结直肠癌有很高的特异性和敏感性，SFRP1基因在组织中特异性为 100%和敏感性为95.1 % (Nat Genet. 2002化η; 31 (2): 141-9 .)，而在粪便中敏感性降为 52%(Adv Biomed Res.2012Dec 28;1:87.);SFRP2基因在组织中对结直肠癌的特异性为 99%和敏感性为89.5 % (Nat Genet. 2002化η; 31 (2): 141-9 .)，而在粪便中特异性降为 77 %，敏感性降为77 % (Lancet. 2004Apr 17; 363(9417): 1283-5.)。
[0008] 因此，粪便样本的分子检测，目前仍很难应用于临床检测。
【发明内容】
[0009] 本发明目的在于筛选出一种在粪便中的检测敏感性不亚于组织中的肿瘤标记物。
[0010] 本发明的进一步目的在于提供一种能W粪便作为检测样本的肿瘤分子检测/诊断 试剂。其可W对结直肠癌或癌前腺瘤进行分子检测/诊断。并且该检测试剂即使W粪便作为 检测样本仍能获得很好的敏感性和特异性。
[0011] 本发明首次筛选出一种分子标记物，与其他分子标记物不同的是，该分子标记物 在粪便中的检出量与结直肠癌存在极高的对应关系。其检测结果的敏感性和特异性甚至不 亚于组织样本中的检测结果。
[0012] 发明提供了一种结直肠癌分子检测/诊断试剂，其特征在于W粪便作为检测样本， 并且含有SDC2基因甲基化检测试剂。
[0013] 本发明筛选出的运个特殊的分子标记物即是SDC2基因。
[0014] SDC2基因是已知的一种参与细胞分裂、迁移和在结肠间充质细胞中表达的蛋白 质。据发现，肿瘤组织中SDC2目标区域的甲基化水平，显著地更高于成对相邻非肿瘤组织中 的SDC2目标区域。通过分析133例CRC患者原发肿瘤和其成对相邻非肿瘤组织样本中的SDC2 甲基化水平，研究人员发现，SDC2基因的转录调控区域中，肿瘤组织样本显示甲基化水平显 著地更高于对照的相邻非肿瘤组织样本。
[0015] SDC2基因发生甲基化的位点相对恒定，多发生在启动子区的CpG岛。目前，常用的 SDC2基因甲基化检测方法多为针对CpG岛固定位点的甲基化检测。
[0016] 甲基化的发生是胞喀晚上多了一个甲基，经过亚硫酸氨盐处理后，胞喀晚会变成 脈喀晚，因为在进行PCR扩增时尿喀晚与胸腺喀晚相似而会被识别为胸腺喀晚，体现在PCR 扩增序列上就是没有发生甲基化的胞喀晚变成了胸腺喀晚(C变成T)，甲基化的胞喀晚(C) 则不会发生变化。PCR检测甲基化基因的技术通常为MSP，针对处理后的甲基化片段（即片段 中未改变的C)设计引物，进行PCR扩增，如果有扩增则说明发生了甲基化，无扩增则没有甲 基化。
[0017] SDC2基因在组织中的甲基化水平与结直肠癌的发病关联度是很高的。139例组织 中SDC2基因甲基化检出率为97.8%，131例肠癌和125例正常患者的血液检测中，特异性为 95.2%时，敏感性为87%(0h,T.,et al.,The Journal of Molecular Diagnostics, 2013)。而让发明人意外的发现是，SDC2基因在粪便中所检出的甲基化水平与结直肠癌的发 病也保持了极高的关联度，其敏感性为87%，特异性高达98%，甚至高于组织中的特异性。 运在分子标记物中是极少见的，甚至是绝无仅有的。
[0018] 在发明人研究的多种分子标记物中，无一不是粪便样本的检测敏感性或特异性对 比组织样本大幅下降。例如，NDRG4基因运种结直肠癌分子标记物，其在组织中的检测敏感 性为81 %，但是，在粪便中的检测敏感性降低至65.2% ;BMP3基因在组织中的检测敏感性为 66 %，而在粪便中的检测敏感性降低至39.0 %，Sept in9基因在组织中的检测特异性为 90%，而在粪便中的检测特异性降低至43%。研究发现，多种肠癌标记物仅在组织中显示出 良好的检测敏感性和特异性；而在粪便样本中，无论如何设计和优化提取方法、检测引物 等，敏感性或者特异性仍大幅下降，严重影响了肠癌的诊断。
[0019] 而SDC2基因在粪便样本中仍然保持了高达87%的敏感性和98%的特异性，运使得 运种基因极其特别地可W作为粪便样本中可靠的肠癌标记物。
[0020] 进一步地，发明提供了一种便于粪便中SDC2基因的提取和检测的方法。
[0021] 磁珠捕获方法是采用磁珠作为固相吸附载体并使用特定设计的试剂体系及提取 流程（Journal of畑ina Medical University应用磁珠法检测并提取尿液游离甲基化 DNA；2015,(!0))〇
[0022] 磁珠捕获序列可W通过针对SDC2基因来设计。在本发明中，提供的示例性捕获序 列如SEQ ID N0.1或SEQ ID ^.2所示。通过磁珠捕获的方式，可^对粪便中的50〔2基因进 行提取和富集。
[0023] 粪便的处理方式可选地为:将粪便在缓冲液中混匀、离屯、、取上清至另外一个试管 中，加入带有特定互补寡核巧酸捕获探针（例如优选的S E Q I D N 0 . 1 : AGCCCGCGCACACGAATCCGGAGCAGAGTACCG)的磁珠至上清液中，经过解育杂交后，用磁铁将磁 珠吸附于管壁一侧，经过反复洗净后，用缓冲液将目标基因 DNA洗脱。该法可W俘获到目的 基因，富集的过程约为2个小时。
[0024] 被俘获的DNA经过重亚硫酸盐处理修饰后用于后续巧光定量PCR的检测。
[0025] 进一步地，本发明针对甲基化多发和恒定的启动子去CpG岛来设计引物和探针。示 例性的引物如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO.4;或沈Q ID NO. 5、SEQ ID NO.6;或沈Q ID NO. 7、 569 10側.8;或569 10顯.9、沈9 10側.10;或569 10顯.11、569 10^).12;或沈9 10 NO. 13、沈Q ID NO. 14;或沈Q ID NO. 15、沈Q ID NO. 16;或沈Q ID NO. 17、沈Q ID NO. 18;或 569 10側.19、569 10^).20;或569 10顯.21、569 10^).22;或沈9 10顯.23、569 10 NO. 24所示。
[00%] 在一个优选的实施例中，采用的引物为沈Q ID NO.3、SEQ ID NO.4。
[0027] 为了进一步方便结果的显示，本发明设计了检测探针。示例性的探针序列如SEQ ID NO. 25或SEQ ID NO. 26所示。在本发明的一个优选的实施例中，探针序列如SEQ ID NO. 26所示。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：
[0029] 1.本发明所提供的结直肠癌诊断试剂可W简便地W粪便作为检测样本，对结直肠 癌进行可靠的诊断。本发明使用的检测样本是病人的粪便样本。样品获得非常容易，而且不 会对病人造成任何的痛苦和不便。使用样本量极少，取样过程非常方便且对