玉米赤霉烯酮的检测方法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属纳米生物传感以及生物检测技术领域，涉及玉米赤霉烯酮的检测方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]玉米赤霉烯酮主要由禾谷镰刀菌产生，粉红镰刀菌、窜珠镰刀菌、三线镰刀菌等多种镰刀菌也能产生这种毒素。李季伦1980年研究发现，许多农作物如小麦、大豆等植物中也存在玉米赤霉稀酮。玉米赤霉稀酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的阳性检出率为45%，最高含毒量可达到2909mg/kg;小麦的检出率为20%，含毒量为0.364?11.05mg/kg。玉米赤霉稀酮的耐热性较强，110°C下处理Ih才被完全破坏。
[0003]玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用，能造成动物急慢性中毒，引起动物繁殖机能异常甚至死亡，可给畜牧场造成巨大经济损失。
[0004]因此对玉米赤霉烯酮检测显得十分必要。
[0005]现有分析方法有色谱、免疫法，前者灵敏度不够，后者存在试剂贵、易失活等缺点。中国专利CN102443585A公开了一种玉米赤霉烯酮核酸适体及其应用，其可用于玉米赤霉烯酮的检测，但存在生物标记的DNA价格昂贵的问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括如下步骤:
[0007](A)使玉米赤霉稀酮核酸适体(Apt)和可与玉米赤霉稀酮核酸适体杂交的单链信号探针DNA( Sp)杂交，形成杂交链；
[0008](B)使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有玉米赤霉烯酮存在时，杂交链选择性地与玉米赤霉烯酮反应释放出单链信号探针DNA;
[0009 ] (C)为了消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA切成碎片，留下单链信号探针DNA;
[0010](D)利用银离子在玉米赤霉烯酮核酸适体-玉米赤霉烯酮结合体中不能被还原生成荧光发射峰在630nm左右的银纳米簇，银离子只在单链信号探针DNA(Sp)中还原并生成被Sp修饰的在630nm左右(发射峰位置)有强的荧光发射的银纳米簇的原理，在银离子还原检测体系中检测体系的荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素玉米赤霉烯酮的含量。
[0011]所述银离子还原检测体系包括先后添加的银离子和使银离子迅速还原成单质银的还原剂，例如硼氢化物。例如硼氢化钠。步骤(D)的检测例如包括依次先后向体系中加入银离子溶液和硼氢化钠溶液，反应后生成荧光发射峰在630nm左右的银纳米簇。
[0012]在一个实施方式中，所述玉米赤霉稀酮核酸适体为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3’。
[0013]在一个实施方式中，所述可与玉米赤霉烯酮核酸适体杂交的单链信号探针DNA为5，-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACTTCACACGATT-3，。
[OOM]本发明的检测原理如下:先让Apt与Sp杂交(下划线部分)；当有玉米赤霉稀酮存在时，杂交链与玉米赤霉稀酮反应释放出Sp;体系中存在Apt-Sp (剩余的)，Apt-玉米赤霉稀酮和Sp。银离子在Apt-玉米赤霉稀酮中不能被还原生成焚光发射峰在630nm左右的银纳米簇，Apt-玉米赤霉稀酮的存在对测定无干扰;杂交链可能有干扰;为了消除杂交链的干扰:a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用外切酶，将双链DNA切成碎片。此时体系中只留下Sp，银离子在Sp存在下还原并生成被Sp修饰的焚光发射峰在630nm左右的银纳米簇，通过检测体系的荧光强度，从而可以测定真菌毒素玉米赤霉烯酮的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰，可以提高检测的灵敏度和精度。
[0015]本发明另外提供了一种检测玉米赤霉烯酮的试剂盒，其至少包括:玉米赤霉烯酮核酸适体、可与玉米赤霉烯酮核酸适体杂交的单链信号探针DNA、DNA扩增体系、外切酶、银离子还原检测体系。
[0016]在上述试剂盒的一个实施方式中，所述玉米赤霉稀酮核酸适体为5’ -GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3’。
[0017]在上述试剂盒的一个实施方式中，所述可与玉米赤霉稀酮核酸适体杂交的单链信号探针DNA为5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACTTCACACGATT-3 ’。
[0018]在一个实施方式中，所述DNA扩增体系包括缓冲溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2S04)、三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液(dNTP)和Phi 29DNA聚合酶。
[0019]在一个实施方式中，所述外切酶为ExoIII核酸外切酶。
[0020]本发明还提供了一种可用于检测玉米赤霉烯酮的玉米赤霉烯酮核酸适体，其碱基序列为5 ’ -GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3，。
[0021 ]本发明的优点
[0022]根据本发明的检测方法和试剂盒，可以消除干扰，提高玉米赤霉烯酮的检测灵敏度和精度。
【附图说明】
[0023]图1为Sp-Ag纳米簇荧光激发与发射光谱。
【具体实施方式】
[0024]以下通过【具体实施方式】来说明本发明。
[0025]本发明的检测玉米赤霉烯酮的试剂盒至少包括:使玉米赤霉烯酮核酸适体、可与玉米赤霉烯酮核酸适体杂交的单链信号探针DNA、DNA扩增体系、外切酶、银离子还原检测体系O
[0026]在上述试剂盒的一个实施方式中，所述玉米赤霉稀酮核酸适体为5’ -GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3’。
[0027]在上述试剂盒的一个实施方式中，所述可与玉米赤霉稀酮核酸适体杂交的单链信号探针DNA为5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACTTCACACGATT-3 ’。
[0028]在一个实施方式中，所述DNA扩增体系包括缓冲溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2S04)、dNTP 和 Phi29DNA 聚合酶。
[0029]在一个实施方式中，所述外切酶为Exo III核酸外切酶。
[°03°]使Apt与Sp杂交(下划线部分)；当