ZNF268基因的一种剪切本ZNF268a在实体瘤中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明设及ZNF268基因剪切异构体的应用，更具体地说设及剪切本ZNF268a的应 用。
【背景技术】
[0002] 人类锋指蛋白基因 ZNF268来源于3-5周龄胚胎cDNA文库，编码典型的KRAB/C2H2 型锋指蛋白（参见：第一篇：Gou D M, Sun Y, Gao L, et al. Cloning and characterization of a novel Kruppel-like zinc finger gene, ZNF268, expressed in early human embryo[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2001, 1518(3): 306- 310.;第二篇：Sun Y, Gou D M, Liu H, et al. The KRAB domain of zinc finger gene ZNF268: a potential transcriptional repressor[J]. lUBMB Life, 2003, 55(3): 127-131.)。研究表明ZNF268在胚胎肝脏细胞内高表达，与造血功能密切相关(参见:Sun Y， Shao Η, Li Ζ, et al. ZNF268, a novel kruppel-like zinc finger protein, is implicated in early human liver development!!J]. International Journal of Molecular Medicine, 2004, 14(6): 971-975. )〇
[0003] 进一步研究显示通过GATAl下调ZNF268表达，能够促进K562细胞增殖;ZNF268异常 表达则影响卵巢肿瘤的生长和迁移;ZNF268通过强化NF-KB信号参与宫颈癌发生（参见:第 一篇：Wang W, Guo Μ, Hu L, et al. The zinc finger protein ZNF268 is overexpressed in human cervical cancer and contributes to tumorigenesis via enhancing NF-k曰卵曰B sign曰ling[J]. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287 (51): 42856-42866.;第二篇：Zeng Y, Wang W, Ma J, et al. Knockdown of ZNF268, which is transcriptionally downregulated by GATA-1, promotes proliferation of K562 cells[J]. PloS One, 2012， 7(1): e29518.;第Ξ篇：Hu L, Wang W, Cai J, et al. Aberrant expression of ZNF268 alters the growth and migration of ovarian cancer cells[J]. Oncology Letters, 2013, 6(1): 49-54.)。
[0004] 国家知识产权局公开说明书，CN 101422617 B，公开了一种ZNF268基因剪接异构 体在抗白血病中的应用。该发明指出，ZNF268基因的剪切本ZNF268a在所检测的人组织和细 胞系中都有表达，而在所检测的部分白血病人外周血中的表达量明显降低，W至于在有的 样品中通过PCR方法无法检测到。具体地说，该发明共抽样检查了 49例白血病病人血样，通 过PCR实验，显示41例表达了ZNF268a(占比83.7%);另有9例没有表达ZNF268a(占比16.3%)。 作为对照组，共抽样检查了 16例正常人血样，通过PCR实验，显示16例都表达了 ZNF268a(占 比100%)。而同步检测的ZNF268基因的另一种剪切本ZNF268b，在49例白血病病人血样和16 例正常人血样中都有表达，即表达率都是100%。该发明同时指出，可W通过PCR的方法检测 ZNF268a的含量，从而判断是否患有白血病。很显然，该发明只描述了 ZNF268a与白血病的关 系，而没有检测ZNF268a在实体瘤中的表达情况。
[000引肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等实体瘤是我国主要的癌症发病形式，发病率和死亡率 均高于世界平均水平(参见:第一篇:王永川，魏丽娟，刘俊田等.发达与发展中国家癌症 发病率与死亡率的比较与分析[J].中国肿瘤临床，2012，（10): 679-682.;第二篇：陈 万青，郑荣寿，张思维等.2003~2007年中国癌症发病分析[J].中国肿瘤，2012， (03): 161-170.)。在各种情况中，有重要的原因研究和开发ZNF268a与实体瘤的关系，因为 ZNF268a可W用作癌症发病的分子标记物，也可W在治疗和预后过程中，作为祀基因或潜在 药物。
【发明内容】
[0006] 本发明人已经努力从各种实体瘤中检测ZNF268a的表达情况。作为结果，本发明人 共收集了 5例实体瘤标本，分别是胃癌2例、结肠癌1例、肝癌1例、乳腺癌1例;作为对照，共收 集了 17例正常人外周血样本。通过提取总RNA反转录合成cDNA，使用PCR、巢式PCR和测序的 方法调查ZNF268a在样本中的表达情况。结果显示，剪切本ZNF268a在正常人外周血中表达 概率为100%，而在实体瘤中为0%;即实体瘤都没有表达ZNF268a，而正常人外周血都表达了 ZNF268a。同步检测的ZNF268基因的另一种剪切本ZNF268b，在正常人外周血和实体瘤中，表 达的概率都是100%。
[0007] 所W，本发明的目的是提供ZNF268基因的一种剪切本ZNF268a在实体瘤中的应用， 该剪切本在实体瘤中的含量显著降低，剪切本ZNF268a在实体瘤中的含量可W下降到PCR技 术无法检测到阳性条带的程度，实体瘤可W是胃癌、结肠癌、肝癌或乳腺癌。
[0008] 本发明的详细描述如下。
[0009] 本发明的优选的引物，该引物的SEQ ID NO.、在本发明中的名称及引物碱基序列 列于表1。
[0010] 表1。
[00·Μ]本发明的优选的引物对，及该引物对可W检测的ZNF268基因的剪切本列于表2。如 引物对BUN巧日抓Ν3，可W检测出ZNF268b而无法检测出ZNF268a。详细说明：如果样品中同时 存在ZNF268a和ZNF268b两种剪切本，使用引物对BUN巧日抓N3通过PCR的方法检测该样品，贝U 只能出现ZNF268b的阳性扩增条带，而不会出现ZNF268a的扩增条带。
[0012] 表2。
[0013] 发明结果一:剪切本ZNF268a、ZNF268b在正常人外周血中的表达概率为100%。
[0014] ZNF268基因有8种剪切形式（图1)，其中ZNF268a、ZNF268b丰度最高，是重点研究的 两条mRNA。作为检测实体瘤中ZNF268基因差异拼接模式的对照，本发明收集了 17例外周血 样本。提取总RNA，反转录成cDNA，使用引物对BUN1和BDN3检测样品。该引物对可W检测出 ZNF268b、ZNF268f、ZNF268g(表2)。结果显示17例正常人外周血中，表达ZNF268b的概率是 100%(图2曰）。引物对e4s和抓N2可 W检测ZNF268a、ZNF268b、ZNF268g(表2)，其中ZNF268b和 ZNF268g的PCR产物大小一致。结果显示在样本中ZNF268a表达概率为100%(图2b)。
[0015] 发明结果二:剪切本ZNF268b在实体瘤中表达概率为100%，而ZNF268a表达概率为 0〇/〇。
[0016] 为检测ZNF268基因在实体瘤中的差异拼接模式，本发明收集了 5例样本，提取总 RNA，反转录成cDNA。根据前期报道，ZNF268基因差异拼接发生在3、4、5、6号外显子（图la)。 引物脚3、抓1分别位于第一号、第屯号外显子（图化）。按照预期，运对引物能够检测到所有 的剪切本(表2XPCR和测序结果显示，运对引物只检测到ZNF268b(图3曰）。为进一步验证结 果，本发明使用了另外一对引物进行实验。268.1位于第二号外显子，BDC位于第六号和第屯 号外显子的交界处（图化）。按照预期，运对引物可W检测ZNF268b、ZNF268f、ZNF268g(表2)。 PCR和测序结果再次显示在实体瘤组织中只检测到ZNF268b(图3b)。实验过程中使用β- actin作为内参（图3c)。该结果表明ZNF268b在实体瘤中表达概率为100%，ZNF268a表达概率 为 0〇/〇。
[0017] 发明结果Ξ:巢式PCR再次证明剪切本ZNF268a在实体瘤样本中表达概率为0%。
[0018] 上面的结果说明，ZNF268基因在实体瘤中都表达了 ZNF268b，而ZNF268a表达概率 为0%。运个结果非常意外，该结果有可能是ZNF268a丰度过低，W至于单论PCR无法检测阳性 结果。为排除运种可能性，本发明使用特异性更强灵敏度更高的巢式PCR法，进一步确认剪 切本ZNF268a是否存在。首先使用BU3和NBD2进行第一轮PCR扩增，然后用巢式引物对BU1和 抓1(图4a)或者268.1和抓1(图4b)进行巢式PCR。运Ξ对引物都可W检测到所有剪切本(表 2)，脚3、NBD2位于其他引物的外侧（图化）。根据预测，如果实体瘤样本中存在ZNF268a，那么 巢式PCR至少应该扩增出两条条带，分别是ZNF268a和ZNF268b。电泳结果显示只有一条扩增 条带，再次证明ZNF268a在实体瘤中表达概率为0%。
[0019] 本发明的结论。
[0020] 本发明W17例正常人外周血为对照，收集并分析了5例实体瘤样本的ZNF268基因 差异拼接模式。通过PCR、巢式PCR和测序的方法，发现剪切本ZNF268a在正常人外周血的表 达概率为100%，而在实体瘤中为0%。本研究提示ZNF268a消失与细胞癌变密切相关，是潜在 的癌症诊断分子标记。
[0021] 本发明与现有技术相比，具有W下优点和效果。
[0022] 1、本发明拓宽了国家知识产权局公开说明书，CN 101422617 B，所描述的剪切本 ZNF268a的使用范围。CN 101422617 B说明书把ZNF268a的应用限定在白血病之中。本发明 把剪切本ZNF268a应用于实体瘤，拓宽了剪切本ZNF268a的使用范围。
[0023] 2、本发明更为深刻地展示了ZNF268a与癌症的密切相关性。CN 101422617 B说明 书的结果显示，在49例白血病病人血样中，有9例没有表达ZNF268a，占比16.3%。本发明的结 果显示，在5例实体瘤的样本中，5例都没有表达ZNF268a，占比100%。
[0024] 运两者结果的差异，可能是CN 101422617 B使用的取样方式造成的。CN 101422617 B抽取的是白血病病人的全血，在全血当中，由于病人所处的白血病的阶段不一 样，所W癌细胞的比例也不一致。处于白血病晚期的病人样本，血液中癌细胞占比高，所W 检测的结果是ZNF268a明显下降甚至无法用PCR的方法检测到。处于白血病早期的病人样 本，血液中癌细胞占比低，正常细胞多，而正常细胞可W表达ZNF268a，所W作为全血的样 本，可W检测出ZNF268a。
[0025] 而在本发明中，所取的样本是实体瘤组织，整个组织炔基本都是癌细胞，所W本发 明排除了正常细胞对实验结果的干扰，更能够真实地反映剪切本ZNF268a的本质。在肿瘤细 胞中，细胞不表达剪切本ZNF268a的概率是100%。该结果与CN 101422617 B的结果相比，不 只是数量上的提升，更是质上的飞跃。
[0026] 本发明展示了 ZNF268基因的一种剪切本ZNF268a在所调查的全部实体瘤样本中 不表达，结合CN 101422617 B的发明结果，因此，对于该剪接本ZNF268a的检查可W成为癌 症诊断的依据。
[0027] 本发明设及ZNF268基因的一种剪切本ZNF268a在实体瘤中的应用。通过对本发明 提供的一种ZNF268基因剪切本ZNF268a多