一种猪病毒性腹泻病毒5重rt-pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测试剂盒及这种检测试剂盒在非疾病检测的使用方法，确切讲本发明是一种用于猪病毒性腹泻病毒5重RT-PCR检测试剂盒及相应的使用方法，所述的5重猪病毒性腹泻病毒是指:猪流行性腹泻病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪轮状病毒，猪札幌病毒和猪嵴病毒。
【背景技术】
[0002]猪病毒性腹泻是严重危害养猪业的重要传染病之一，造成猪病毒性腹泻的最主要病原有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(RV)等。近年来，札幌病毒、嵴病毒以及诺如病毒等也分别在腹泻猪及健康猪群中分别检测到。这些病毒是引起猪群或猪场发生病毒性腹泻主要病原，危害重大，每年对养猪业造成极大的经济损失。除此之外，上述几种病毒引起的病毒性腹泻的临床症状、病理变化、流行特点极其相似，仅凭临床诊断很难进行鉴别诊断，因而常导致误诊，因此该病的防控及其早期诊断及鉴别诊断显得尤为重要。然而，腹泻病的病因复杂以及现有诊断方法的局限性，导致基层兽医和养殖场对腹泻病的确诊很困难，使腹泻病的防控不能做到有的放矢、对症下药。导致该现象发生的最根本原因是现在缺少可应用的快速、准确、方便的商品化诊断试剂盒。长期以来针对猪病毒性腹泻的检测试剂盒主要是以传统的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(RV)的血清学检测方法为主，然而，近年来猪病毒性腹泻疫情发生了两个重大变化:第一，主要引起哺乳仔猪发病、死亡，而哺乳仔猪免疫系统尚未发育健全，未能有效产生血清抗体;第二，在近年来的猪病毒性腹泻疫情中，猪札幌病毒和嵴病毒等新型病毒时有存在，针对于此两种病毒目前尚未有成熟的检测方法。由此可见，现有的检测猪病毒性腹泻的检测试剂盒并不能满足目前疫病诊断的需求，因此急需研制符合当前疫情流行趋势的商品化检测试剂盒，且目前没有可以一次性检测、诊断和鉴别诊断上述5种病原的PCR商品化试剂盒。
【发明内容】
[0003]本发明的技术任务在于提供一种可克服现有不足的，具有特异、敏感、快速、使用方便、廉价的用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪嵴病毒的5重RT-PCR检测试剂盒，同时提供这一试剂盒在猪病毒性腹泻诊断检测中的使用方法。
[0004]本发明的一种猪病毒性腹泻病毒5重RT-PCR检测试剂盒内包括有SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQID N0.8、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10的十条引物。其中这些特异性引物分别为:
SEQ ID N0.1(KF):ggcattgacatgaatcaggc, SEQ ID N0.2(KR):gcgatcgtaggtcttcgg;SEQ ID N0.3(TF):gggccaacgtaaagagcttcc,SEQ ID N0.4(TR):
gctctgacctttctgcag；SEQ ID N0.5(PF ):taggactcgtactgagggtgt，SEQ ID N0.6( PR ):
ctattttcgcccttgggaatt；
SEQ ID N0.7(RF):gtatggtattgaatatacc?SEQ ID N0.8(RR):tagactgatccagttggc；SEQ ID N0.9(SF):tacagcaagtgggac，SEQ ID N0.lO(SR):atgacactggtgaacggcat〇
[0005]为方便使用，本发明的一种猪病毒性腹泻病毒5重RT-PCR检测试剂盒内还包括:A.六碱基随机反转录引物;B.反转录预混体系;C.PCR扩增预混体系;D.阳性cDNA对照;E.阴性cDNA对照，所述的反转录预混体系包括有:预混的反转录缓冲液、dNTP、RNA酶抑制剂、反转录酶和DEPC水，PCR扩增体系包括有:PCR缓冲液、上述10条引物混合物、dNTP、Taq酶、双蒸水。
[0006]本发明的5重RT-PCR检测试剂盒检测用于猪病毒性腹泻病毒的非疾病检测的使用方法是:先从待检猪的待检样品中通过Trizol法或RNA提取试剂盒提取RNA，利用本发明的试剂盒内的六碱基随机反转录引物(A)和反转录预混体系(B)反转录为cDNA，以所得到的待检cDNA为模板，用试剂盒内的PCR扩增预混体系(C)进行扩增，根据所扩增的PCR片段大小不同来判定待检样品是否感染一种病原，或是混合感染猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒或/和猪嵴病毒。具体操作时根据扩增产物的核酸电泳图中是否出现特定条带，参照阳性(D)和阴性(E)对照以及DNA分子量标准确定待检猪样品是否感染猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒或/和猪嵴病毒。
[0007]本发明的试剂盒最佳的使用方法中，PCR扩增预混体系中各引物终浓度为:SEQ IDN0.l和SEQIDN0.2各为0.2pmol/μL;SEQIDN0.3和SEQIDN0.4各为0.05pmol/μL;SEQIDN0.5和SEQIDN0.6各为0.3pmol/μL;SEQIDN0.7和SEQIDN0.8各为l.6pmol/μL;SEQIDN0.9和SEQIDN0.10各为0.2pmol/μL，反应体系为:EcoTaql2.5μL，cDNA5μL，引物混合物7.5仙，(1(1!120补平至总体系25μΜ反应条件为:94°C 4min;94°C 45s，52°C 45s，72°C lmin，35个循环；72°C延伸10min;16°C保存；对各引物所扩增的片段长度为:SEQ IDN0.1 和SEQ ID N0.2的长998bp;SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4长为820bp;SEQ ID N0.5和SEQID N0.6长为600bp; SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8长为350bp; SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10长为194bp。
[0008]利用本发明检测试剂盒可对同时猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪嵴病毒检测，其优点在于:根据病原的保守基因的高度保守区设计特异性引物，利用不同病原的特异性引物所扩增的片段大小不同，实现对引起猪病毒性腹泻病因的检测。根据扩增片段长度的差异可以准确的判定引起猪病毒性腹泻的病原，快速确诊是单一病原感染引起或是混合感染造成，该方法方便快捷，不仅能为对症治疗提供依据，还可为猪病毒性腹泻的流行病学调查提供可靠的信息。
[0009]本研究发明试剂盒中的引物是根据引起猪消化道病毒病主要病原的保守基因的高度保守区设计特异性引物，并采用不同病原PCR扩增产物长度不同的策略，建立了检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪嵴病毒的5重RT-PCR检测方法，为及时治疗和防控疫情提供最直接的依据，为养猪业的健康发展保驾护航。
【附图说明】
[〇〇1〇]图1:猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪嵴病毒单一引物扩增结果；
图2:猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪嵴病毒5重RT-PCR最佳反应条件扩增结果；
图3:猪腹泻病毒5重RT-PCR检测方法特异性检测结果；
图4:猪腹泻病毒5重RT-PCR检测方法单一引物敏感性检测结果；
图5:猪腹泻病毒5重RT-PCR检测方法5重混合引物敏感性检测结果；
图6:猪腹泻病毒5重RT-PCR检测方法批间重复检测结果；
图7:猪腹泻病毒5重RT-PCR检测方法批内重复检测结果。
【具体实施方式】
[0011]以下结合具体实例和【附图说明】对本发明做进一步说明
本发明的猪病毒性腹泻病毒5重RT-PCR检测试剂盒的使用方法是先将待检猪的待检样品通过Trizol法或RNA提取试剂盒提取RNA，利用本发明的试剂盒内取5tiL提取的总RNA与2μL六碱基随机反转录引物(A)混合后于70°C水浴锅中孵育