稳定，具有很好的遗传稳定性，可以作为进一步研究和开发产业化菌株。
[0022] 实施例3 本实例说明通过加入特异性底物和表面活性剂发酵辅酶I的生产工艺 从实施例1选择性培养基上挑取十个单菌落，分别记为A1~10,将该十个菌株分别接种 到4mL含50ug/ml的卡那霉素LB培养基中，37°C，200rpm，培养4小时后按1%(ν/ν)接种量接入 发酵培养基中，发酵培养基为葡萄糖50g/l，酵母膏5g/Ι，氯化钠2g/Ι，硫酸镁1g/Ι，磷酸 二氢钾1g/Ι，磷酸氢二钠1g/Ι，烟酰胺1g/Ι、腺嘌呤2g/l，pH=7.0-7.2,摇瓶装液量20%， 摇床转速为200r/min，发酵温度32°C，当0D600在0.6-0.8时加入终浓度为0.5mMIPTG诱导 培养12-16h，后加入终浓度为4g/Ι十二烷基苯磺酸钠，继续培养8h，测定发酵液中辅酶I的 含量达到，结果见表2。
[0023] 表2
实施例4本实施例说明基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌的方法 本实施例步骤1)~2)同实施例1，区别仅在于步骤3)，具体为： 将步骤2)的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌:取已培养好的感受态大 肠杆菌BL21用无菌水制成浓度大约为1X106个/mL孢子悬浮液;取100yL孢子悬浮液加入 50yL步骤2)构建的重组质粒pet28a-phzM，均勾涂布到无菌空平板上，以无菌风吹干，在能 量为16Kev，注入剂量为120X1014ions/cm2，靶室真空度为1.2Xl(T3Pa进行氮离子注入介 导，注入完毕后，在无菌环境下用lml无菌水进行洗脱;取洗脱液50yL在无菌条件下均匀涂 布到加入50ug/ml的卡那霉素平板培养基上，在37°C下培养12-24小时，即可获得重组大肠 杆菌。
[0024] 实施例5 本实例说明通过加入特异性底物和表面活性剂发酵辅酶I的生产工艺 从实施例4选择性培养基上挑取十个单菌落，分别记为B1~10,将该十个菌株分别接种 到4mL含50ug/ml的卡那霉素LB培养基中，37°C，200rpm，培养4小时后按1%(ν/ν)接种量接入 发酵培养基中，发酵培养基为葡萄糖50g/l，酵母膏5g/1，氯化钠2g/1，硫酸镁1g/1，磷酸 二氢钾1g/Ι，磷酸氢二钠1g/Ι，烟酰胺1g/Ι、腺嘌呤2g/l，pH=7.0-7.2摇瓶装液量20%， 摇床转速为200r/min，当当0D600在0.6-0.8时将温度转为32°C，并加入终浓度为0.5mM IPTG诱导培养12-16h后加入终浓度为4g/1十四烷基苯磺酸钠，继续培养6h，测定发酵液中 辅酶I的含量达到，结果见表3。
[0025]表3:
实施例6 本实例说明重组菌在5L发酵罐中发酵产辅酶I 从实施例4选择性培养基上挑取十个单菌落，分别记为C1~10,将该十个菌株分别接种 到4mL含50ug/ml的卡那霉素LB培养基中，37°C，200rpm，培养4小时后按1%(ν/ν)接种量接入 5L发酵罐中，发酵培养基为葡萄糖50g/l，玉米浆8g/l，氯化铵4g/l，氯化钠0.8g/Ι，磷酸二 氢钾0.5g/l，磷酸氢二钠1g/Ι，烟酰胺3g/Ι、腺嘌呤2 8/1，？!1=7.0-7.2，发酵罐转速 300rpm，37°C培养，当0D600在0.6-0.8时将温度转为32°C，并加入终浓度为0.5mMIPTG诱导 培养12-16h后加入终浓度为5g/Ι十二烷基苯磺酸钠，继续培养6h，测定发酵液中辅酶I的 含量达到，结果见表4。
[0026]表4
实施例7 本实例说明CaCl2法转化质粒构建的重组大肠杆菌及其发酵产辅酶I挑取E.coliBL21单菌落接种至有50mlLB液体培养基的三角瓶中，37°C震荡培养2小 时（摇床转速250r/min)。吸取1.4ml菌液至Eppendorf管于7000g离心2min，弃上清，并倒置 于吸水纸上，重复三次。将细菌悬浮于lml预冷的0.1MCaCl2溶液中，置冰浴lOminJOOOg离 心2min，弃上清，收集菌体。将菌体重悬于200μ1预冷的0.1MCaCl2溶液，冰浴30min。每管加 入质粒DNA50ng/10yl，轻轻混匀，冰浴放置20min，设一不加质粒DNA的对照。将管置于42°C 水浴中2min，迅速转移至冰浴2min。加入800μ1LB液体培养基，37°C培养45min后接种到含 lOOyg/ml卡那霉素的LB冷平板上。将平板倒置入37°C恒温培养箱培养过夜，即可获得重组 大肠杆菌。
[0027]随机挑取CaC12法转化质粒构建的重组大肠杆菌的一个单菌落，接种到4mL含 50ug/ml的卡那霉素LB培养基中，37°C，200rpm，培养4小时后按1%(ν/ν)接种量接入发酵培 养基中，发酵培养基为葡萄糖50g/l，酵母膏5g/Ι，氯化钠2g/Ι，硫酸镁1g/Ι，磷酸二氢钾 1g/Ι，磷酸氢二钠1g/Ι，烟酰胺1g/Ι、腺嘌呤2g/Ι和十二烷基苯磺酸钠4g/l，pH=7.0-7.2摇瓶装液量20%，摇床转速为200r/min，当0D600在0.6-0.8时加入终浓度为0.5mMIPTG 诱导培养，培养温度37°C，发酵12-18h，加入终浓度为4g/1十二烷基苯磺酸钠，继续培养 8h，测定发酵液中辅酶I的含量达到4.57g/L。与离子束介导技术构建重组大肠杆菌的方法 相比，辅酶I产量大大降低。
【主权项】
1. 一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，包括以 下步骤： 1)将烟酰胺核苷激酶基因，连接到载体上，构建表达载体； 将步骤1)的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌； 利用选择性培养基进行重复筛选，获得可以高效表达烟酰胺核苷激酶的重组大肠杆 菌； 将重组大肠杆菌接种到发酵培养基中发酵生产辅酶I。2. 根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方 法，其特征在于，步骤1)所述烟酰胺核苷激酶基因为罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii)ARSEF23的NRK基因片段MAA_05394,所述载体为pet28a。3. 根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方 法，其特征在于，步骤2)中离子束介导的能量为14~18KeV，剂量为(80~200)X1014ions/cm2， 靶室真空度为(1. 〇~2.0)X10-3Pa。4. 根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方 法，其特征在于，步骤3)选择性培养基是在LB培养基中加入50ug/ml的卡那霉素。5. 根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方 法，其特征在于，步骤4)中发酵培养基包含按质量百分比的如下组分:碳源2-6%、氮源0.5-1 %，无机盐0.01 -0.1 %，生长因子0.1 -0.4%，余量为水，pH=7.0-7.2，其中碳源为葡萄糖、鹿糖 和甘油中的至少一种;氮源为酵母膏、玉米浆、蛋白胨和氯化铵中的至少一种;无机盐为氯 化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠中的至少一种;生长因子为腺嘌呤或烟酰胺中的至 少一种。6. 根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方 法，其特征在于，步骤4)接种量为1-5%(V/V)，发酵培养的温度为28-34°C，摇床转速为200-250r/min〇7. 根据权利要求6所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方 法，其特征在于，步骤4)中接种后检测0D在0.6-0.8时加入终浓度为0.5mMIPTG诱导培养 12-16h，然后加入终浓度为0.2-0.5%表面活性剂，继续培养4-8h，其中表面活性剂为十二烷 基苯磺酸钠、十四烷基苯磺酸钠和十六烷基苯磺酸钠中的一种。8. 根据权利要求3所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方 法，其特征在于，步骤2)中离子束介导的能量为18KeV，剂量170X1014ionS/cm2,靶室真空度 为1.6X10-3Pa。
【专利摘要】本发明公开一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法。将烟酰胺核苷激酶基因与pet28a载体连接，构建表达载体，经低能离子束介导作用将表达载体导入大肠杆菌，从而获得产辅酶I重组大肠杆菌，本发明采用离子束介导作用技术将辅酶I合成途径中烟酰胺核苷激酶基因在大肠杆菌中进行重组表达，使重组菌能够多产烟酰胺核苷激酶，从而大幅提高发酵产物辅酶I的含量。在5L发酵罐中其辅酶I产量最高可以达到10.28g/l，具有很高的经济应用价值和产业化前景。
【IPC分类】C12N15/70, C12P19/36
【公开号】CN105463007
【申请号】CN201610009811
【发明人】虞龙, 吴奎, 吴晓菲, 杜玉英
【申请人】南京工业大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月8日