基于宏基因技术从霉变的甘蔗叶中筛选β-葡萄糖苷酶基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶基因，本发明还涉及 一种重组β-葡萄糖苷酶，本发明还涉及一种重组β-葡萄糖苷酶的方法。
【背景技术】
[0002] 随着矿物燃料消耗速率的不断增加、环境和资源危机的加剧，对替代能源生物质 能源的需求和开发日益迫切。纤维素作为植物细胞壁的主要组成部分，是地球上分布最广 泛、含量最丰富的碳水化合物，是生产生物乙醇或其它液体燃料等新能源的最适合的原材 料，可有效的缓解能源危机和环境危机，促进全球经济的可持续发展。
[0003]自然界中存在着多种高效降解纤维素的生物系统，利用微生物产生的木质纤维素 水解酶来降解木质纤维素是纤维素利用的一种有效途径。木质纤维素的降解需要多种酶的 协同作用，主要包括内切纤维素酶(EC3.2.1.4)外切纤维素酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷 酶(EC3.2.1.21)。内切纤维素酶主要作用于纤维素分子中不定型区的非结晶纤维素，随机 水解纤维素分子中的β-1，4_糖苷键，产生新的多糖链末端或可溶性纤维寡糖;外切纤维素 酶主要作用于纤维多糖链的还原型末端或非还原型末端，水解β-1，4_糖苷键，释放出纤维 二糖或葡萄糖分子;葡萄糖苷酶主要是将天然纤维素水解的后期将内切和外切纤维素酶 产生的寡糖(主要是纤维二糖)水解为葡萄糖。在纤维素的降解过程中葡萄糖苷酶参与纤 维素水解的最后一步，常被认为是纤维素降解过程的限速酶，同时也是利用纤维素酶进行 高效的生物质转化的主要瓶颈之一。
[0004]β-葡萄糖苷酶在自然界中分布十分广泛，普遍存在于植物、微生物及哺乳动物的 肠道中，不同来源的葡萄糖苷酶的性质各不相同，从而导致各具特色的应用范围。目前， 已报道的葡萄糖苷酶的多为酸性酶，其最适反应pH大多在pH4.5-5.0之间。此外，研究表 明一般情况下，葡萄糖苷酶对其水解产物非常敏感，极低浓度的葡萄糖就能反馈抑制β_ 葡萄糖苷酶的活性。提高纤维素的降解效率，急需寻找具备新的酶学性质的葡萄糖苷酶。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种β_葡萄糖苷酶基因。
[0006]本发明还提供一种重组β_葡萄糖苷酶。
[0007]本发明还提供一种重组β_葡萄糖苷酶的筛选方法，解决了现有技术中存在的酶在 碱性条件下活性不高以及对水解产物非常敏感的问题。
[0008]本发明所采用的第一技术方案是，一种β_葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。
[0009]本发明所采用的第二技术方案是，一种重组β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ IDΝ0.2所示。
[0010] 本发明所采用的第三技术方案是，一种重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，包括以下 步骤：
[0011] 1)、霉变甘蔗叶微生物宏基因组0嫩的提取:收集霉变的甘蔗叶1(^，并将其剪至1-3cm长度，放入250ml三角瓶中；加入富集培养液，30°C震荡培养72h;离心收集菌体，菌体重 悬于1.35mlDNA抽提buffer，混匀后加入0.15ml20%SDS，65°C水浴2h，期间每隔20min上 下颠倒10次并液氮冷冻2min;6000g离心lOmin，收集上清，加入等v的氯仿，上下颠倒混匀； 6000g离心lOmin，收集上清，加入0.6v的异丙醇，室温沉淀2h; 16000g离心20min，弃上清，沉 淀用75%的乙醇洗涤两次后，用ddH20溶解，即得粗提液；
[0012] 2)、构建宏基因组文库：用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的大小，用核酸电泳检 测仪检测DNA的浓度及纯度，对DNA进行纯化，并用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA，回收 3-10kb的酶切片段;构建宏基因组文库；
[0013] 3)、从宏基因组文库中筛选出β-葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所 示；
[0014] 4)对获得的β-葡萄糖苷酶基因进行克隆、表达，得到β-葡萄糖苷酶重组蛋白，其氨 基酸序列如SEQIDNO.2所示。
[0015]进一步地，步骤1)中富集培养液包括以下组分:羧甲基纤维素钠5g//L;NaN03 2g/L;K2P〇3lg/L;KCl0.5g/L;MgS〇4 0.5g/L;FeS〇4〇.01g/L，余量为水，以上总量为 100ml。
[0016]进一步地，步骤 1)中DNA抽提buffer包括以下组分：100mMTris-HCl，100mMEDTA-Na2，lOOmM磷酸缓冲液，1 · 5MNaCl，1 %CTAB，以上组分总量为1 · 35ml，其中，Tris-HCl的pH 为8 · 0，EDTA-Na2的pH为8 · 0，磷酸缓冲液的pH为8 · 0。
[0017]进一步地，步骤2)中构建宏基因组文库具体为:将回收得到的酶切片段和pUC118/ BamHI(BAP)载体连接过夜，连接产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化后与电转化感受态细 胞混合，冰上放置5min，转移DNA/细胞混合物至预冷的2mm电穿孔容器中，在电压为2，500V 的条件下对电穿孔容器进行脉冲，立即添加900μ1的LB至电穿孔容器中，37°C，180r/min，震 荡培养30min，转化产物涂布到含有100yg/ml氨苄青霉素，0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡 喃糖苷和1〇〇μΜ5_溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的平板上，平板倒置放入37°C培养箱中， 培养15-18h;由此构建一个库容量达100000个转化子、多样性好的宏基因组文库。
[0018]进一步地，步骤3)中从宏基因组文库中筛选出β-葡萄糖苷酶基因具体为：
[0019] 3.1 )β_葡萄糖苷酶基因的筛选:将过夜培养物复制到筛选平板上，37°C培养72h， 挑选颜色为黑色的克隆子，其中，筛选平板为:蛋白胨l〇g/l，酵母粉5g/l，NaCl10g/l，七叶 苷lg/1，柠檬酸高铁铵2.5g/l，100μg/mlAmp和0.5mMIPTG;
[0020] 3.2)β-葡萄糖苷酶基因的复选:挑取在筛选培养基上颜色为黑色的克隆子，接种 到 10mL含有 100yg/mLAmp、0 · 5mMIPTG的LB培养基中，37°C，180r/min过夜培养，6000Xg，离 心5min收集菌体，磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)洗涤菌体一次，离心收集菌体，磷酸盐缓冲 液重新悬浮菌体，超声波破碎菌体，离心收集上清作为粗酶液进行酶活性的检测；取l〇〇yL 粗酶液和1〇〇μ1 10mM对硝基苯-β-D-葡萄糖苷，37°C放置20min，能够使pNPG溶液由无色变 为黄色的即为阳性克隆，通过筛选得到一个阳性克隆子PUC118-1-1;
[0021] 将阳性克隆子的质粒送去测序公司进行测序，测序结果显示，β-葡萄糖苷酶基因 的核苷酸序列由972个碱基组成，其核酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0022] 进一步地，步骤4中对获得的β-葡萄糖苷酶基因进行克隆、表达，得到β-葡萄糖苷 酶重组蛋白具体为：
[0023] 4.1)、基因片段的克隆:根据测序结果设计引物:Glul和Glu2,引物两端引入能插 入pET-28a( + )载体的Ncol和Xho頂每切位点，引物序列如下：
[0024] Glul:5'ATGGCGGCCATTTACGGTCGGCATAT'3，其序列如SEQIDN0·3所示；
[0025] Glu2:3'CTACCACGTCATCTTCAATCCCAACT'5，其序列如SEQIDN0·4所示；
[0026] 利用两条引物，以质粒PUC118-1-1为模板进行PCR扩增反应，PCR程序为98°C， 4mim，98°C，30s; 56°C30s; 72°C，30s; 25cycles，72°C，lOmin;PCR产物用PCR产物纯化试剂盒 纯化后用Ncol和Xhol双酶切14h，与经过同样处理的pET-28a( + )(Invitrogen)表达载体进 行连接，转化EscherichiacoliBL21(DE3)，转化液涂布在50yg/mL含卡那霉素的LB固体培 养基，37°C培养过夜，随机挑取10株单菌落接种提取质粒DNA，双酶切验证后，送交测序；
[0027] 4.2)、重组β-葡萄糖苷酶Glu417粗酶液的获得及重组β-葡萄糖苷酶:将含有经测 序验证正确质粒的菌株划线至含50yg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37°C培养过夜，随机 挑取重组菌接种至含50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、180r/min摇床培养过夜， 按1:100的接种量转接至50mL的含50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，当生长至OD6〇〇 = 0·6时加入IPTG至终浓度0·3mM，37°C、200r/min培养15小时，14，000Xg离心5min，弃上清， 将菌体重悬于50mL，0.1Μ、ρΗ8.0的磷酸盐缓冲液中，用超声波破碎仪破碎细胞，4°C，12，000 Xg离心20min，收集上清，得到粗重组蛋白，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
[0028]本发明的有益效果是：
[0029] 1)本发明从霉变的甘蔗叶宏基因组文库中筛选到一个β-葡萄糖苷酶基因，通过基 因工程技术对其功能研究，发现该基因能在EscherichiacoliBL21(DE3)中高效可溶性表 达，SDS-PAGE电泳分析确定该酶的分子量为35.9kDa。
[0030] 2)本发明将SEQIDNO. 1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，并转入 EscherichiacoliBL