上述方法测定其酶活性，得到其最适反应pH(以酶 活力最高时记为100%)。在室温下条件，将酶液在pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和 11.0的缓冲液中保存2h，35°C测定剩余酶活，得到酶的pH稳定性。结果如图4和5所示， Glu417的最适反应pH为8.0X1U417在pH4.0-11.0的范围内保持极高的稳定性。
[0071] 3)葡萄糖浓度对β_葡萄糖苷酶酶活性的影响
[0072]在酶液中加入葡萄糖使其终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0和2.5Μ，室温放置2h，然 后在标准条件下测酶活力，以未加葡萄糖的酶液活力为100%。结果如图6所示，低浓度的葡 萄糖对Glu417的酶活力有促进作用，而高浓度的葡萄糖对Glu417的酶活力没有明显的影 响，葡萄糖的抑制常数Ki为1.38M。
[0073] 4)乙醇对β_葡萄糖苷酶酶活性的影响
[0074] 在酶液中加入无水乙醇使其终浓度分别为5%，10%，20%，30%和50%，室温放置 2h，然后在标准条件下测酶活力，以未加乙醇的酶液活力为100%，结果如图7所示，低浓度 的乙醇对Glu417的酶活力没有明显的影响，当乙醇浓度为5 %和10 %时，Glu417的剩余酶活 力分别为98 %和91 %，随着乙醇浓度的提高，Glu417的酶活力逐渐降低，当乙醇浓度达到 30 %时，Glu417的剩余酶活力为47 %。
[0075] 5)NaCl对β-葡萄糖苷酶酶活性的影响
[0076] 在酶液中加入NaCl使其终浓度为0.5Μ、1Μ、1.5Μ、2Μ和2.5Μ，室温放置2h，然后在标 准条件下测酶活力，以未加NaCl的酶液的活力为100%。结果如8所示，低浓度的NaCl对 G1u417的酶活力有促进作用，高浓度的NaCl对G1u417的酶活力没有明显的影响，NaC1浓度 达2.5M，Glu417仍有76%的酶活力。
【主权项】
1. 一种β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. -种重组β-葡萄糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3. -种重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)、霉变甘蔗叶微生物宏基因组DNA的提取:收集霉变的甘蔗叶10g，并将其剪至l-3c m 长度，放入250ml三角瓶中；加入富集培养液，30°C震荡培养72h;离心收集菌体，菌体重悬于 1.35ml DNA抽提buffer，混匀后加入0.15ml 20%SDS，65°C水浴2h，期间每隔20min上下颠 倒10次并液氮冷冻2min;6000g离心lOmin，收集上清，加入等v的氯仿，上下颠倒混勾;6000g 离心lOmin，收集上清，加入0.6v的异丙醇，室温沉淀2h;16000g离心20min，弃上清，沉淀用 75%的乙醇洗涤两次后，用dd H20溶解，即得粗提液； 2) 、构建宏基因组文库：用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的大小，用核酸电泳检测仪 检测DNA的浓度及纯度，对DNA进行纯化，并用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA，回收3-10kb的酶切片段;构建宏基因组文库； 3) 、从宏基因组文库中筛选出β_葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示； 4)、对获得的β_葡萄糖苷酶基因进行克隆、表达，得到β_葡萄糖苷酶重组蛋白，其氨基 酸序列如SEQIDNO.2所示。4. 根据权利要求3所述的重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中富 集培养液包括以下组分:羧甲基纤维素钠5g/L;NaN03 2g/L;K2P03lg/L;KCl0.5g/L;MgS〇4 0.5g/L;FeS〇4 0.01g/L，余量为水，以上总量为100ml。5.根据权利要求3所述的重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中 DNA抽提buffer包括以下组分：100mM Tris-HCl，100mM EDTA-Na2，100mM磷酸缓冲液，1·5Μ NaCl，1%CTAB，以上组分总量为1·35ml，其中，Tris-HCl的pH为8·0，EDTA-Na2的pH为8·0，磷 酸缓冲液的pH为8.0。6. 根据权利要求3所述的重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中构 建宏基因组文库具体为:将回收得到的酶切片段和pUCl18/BamHI(ΒΑΡ)载体连接过夜，连接 产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化后与电转化感受态细胞混合，冰上放置5min，转移DNA/ 细胞混合物至预冷的2mm电穿孔容器中，在电压为2,500V的条件下对电穿孔容器进行脉冲， 立即添加900μ1的LB至电穿孔容器中，37°C，180r/min，震荡培养30min，转化产物涂布到含 有100yg/ml氨苄青霉素，0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷和100μΜ5-溴-4-氯-3-吲 哚-β-D-半乳糖苷的平板上，平板倒置放入37°C培养箱中，培养15-18h;由此构建一个库容 量达100000个转化子、多样性好的宏基因组文库。7. 根据权利要求3所述的重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中从 宏基因组文库中筛选出葡萄糖苷酶基因具体为： 3.1 )β_葡萄糖苷酶基因的筛选:将过夜培养物复制到筛选平板上，37°C培养72h，挑选 颜色为黑色的克隆子，其中，筛选平板为：蛋白胨l〇g/l，酵母粉5g/l，NaCl10g/l，七叶苷 lg/1，柠檬酸高铁铵2.5g/l，100μg/mlAmp和0.5mMIPTG; 3.2)β-葡萄糖苷酶基因的复选:挑取在筛选培养基上的黑色克隆子，接种到10mL含有lOOyg/mLAmp、0·5mMIPTG的LB培养基中，37°C，180r/min过夜培养，6000Xg，离心5min收集 菌体，磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)洗涤菌体一次，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液重新悬浮 菌体，超声波破碎菌体，离心收集上清作为粗酶液酶活性的检测；取l〇〇yL粗酶液和100μ1 lOmM对硝基苯-β-D-葡萄糖苷，37°C放置20min，能够使pNPG溶液由无色变为黄色的即为阳 性克隆，通过筛选得到一个阳性克隆子PUC118-1-1; 将阳性克隆子的质粒送去测序公司进行测序，测序结果显示，β-葡萄糖苷酶基因的核 苷酸序列由972个碱基组成，其核酸序列如SEQIDNO. 1所示。8.根据权利要求3所述的重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，其特征在于，所述步骤4中对 获得的葡萄糖苷酶基因进行克隆、表达，得到葡萄糖苷酶重组蛋白具体为： 4.1) 、基因片段的克隆：根据测序结果设计引物:Glul和Glu2,引物两端引入能插入 pET-28a( + )载体的Ncol和Xho頂每切位点，引物序列如下： Glul:5'ATGGCGGCCATTTACGGTCGGCATAT'3，其序列如SEQIDN0·3所示； Glu2:3'CTACCACGTCATCTTCAATCCCAACT'5，其序列如SEQIDN0·4所示； 利用两条引物，以质粒PUC118-1-1为模板进行PCR扩增反应，PCR程序为98°C，4mim，98 °C，30s; 56°C30s ; 72°C，30s; 25cycles，72°C，lOmin;PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后 用Ncol和Xhol双酶切14h，与经过同样处理的pET-28a( + )(Invitrogen)表达载体进行连接， 转化Escherichia coli BL21(DE3)，转化液涂布在50yg/mL含卡那霉素的LB固体培养基，37 °〇培养过夜，随机挑取10株单菌落接种提取质粒DNA，双酶切验证后，送交测序； 4.2)、重组β-葡萄糖苷酶Glu417粗酶液的获得及重组β-葡萄糖苷酶:将含有经测序验 证正确质粒的菌株划线至含50yg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37°C培养过夜，随机挑取 重组菌接种至含50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、180r/min摇床培养过夜，按1: 100的接种量转接至50mL的含50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，当生长至0D6Q() = 0.6时 加入IPTG至终浓度0.3mM，37°C、200r/min培养15小时，14，000Xg离心5min，弃上清，将菌体 重悬于50mL，0.1Μ、ρΗ8.0的磷酸盐缓冲液中，用超声波破碎仪破碎细胞，4°C，12，000Xg离 心20min，收集上清，得到粗重组蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
【专利摘要】本发明公开了一种β-葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明还公开了一种重组β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明还公开了一种重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，包括以下步骤：霉变甘蔗叶微生物宏基因组DNA的提取，构建宏基因组文库，从宏基因组文库中筛选出β-葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；对获得的β-葡萄糖苷酶基因进行克隆、表达，得到重组β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。该重组β-葡萄糖苷酶在碱性条件下活性很高且对水解产物不敏感。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/10, C12N9/42, C12Q1/34, C12N15/56
【公开号】CN105462999
【申请号】CN201510903621
【发明人】姚健, 陈庆隆, 张 诚, 钟国祥, 桂伦, 王洪秀, 马吉平, 陈柳萌
【申请人】江西省农业科学院农业应用微生物研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月8日