专利名称：一种运载蜂毒肽的多肽、运载蜂毒肽的纳米颗粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物科学和药物载体领域，特别涉及一种一种运载蜂毒肽的多肽、运载蜂毒肽的纳米颗粒及其应用。
背景技术：
蜂毒肽(melittin，GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)是一种两亲性的α 螺旋结构的多肽，是蜂毒中的主要活性成分，占其干重的40%-60%。蜂毒肽的活性很高，具有广谱的抗菌功能，能在极短的时间内发挥其作用，其效率是普通抗生素的上百倍。蜂毒肽对于细胞膜结构具有非常高效的破坏性，包括质膜以及胞内一些细胞器的膜结构。其作用机制主要有通过其两亲性的结构嵌入至膜结构中，然后在膜上打孔，致使膜结构发生破裂，膜内外环境的变化最终导致细胞的死亡；也可以通过影响细胞内介导肿瘤增殖的多条信号通路中的关键蛋白，进而引起细胞凋亡。因此，蜂毒肽在治疗肿瘤方面可以发挥很大功效。除此之外，相关研究表明蜂毒肽还可以通过抑制HIV-1基因的表达及LTR的活性来抑制艾滋病病毒的增殖；也具有抗炎镇痛的作用，镇痛强度是吗啡的40%，镇痛时间持久，抗炎活性是近氢化可的松的100多倍，不会引起免疫抑制的作用；蜂毒肽也能调节肾上腺皮质激素的释放，达到抗风湿、类风湿关节炎的作用；此外，蜂毒肽还能够引起神经内分泌反应，增强机体抗辐射作用以及防止血小板聚集，抗血栓的功效。总之，蜂毒肽在治疗各种疾病上都具有广泛的应用前景。然而，由于蜂毒肽自身的特性，难以将其直接应用于活体的疾病治疗中。因为蜂毒肽在注入血管后会迅速与红细胞结合，破坏细胞膜，以致产生强烈的溶血反应。而且直接将蜂毒肽应用于活体治疗，可能会对机体正常细胞造成破坏，带来极大的毒副作用。另外，蜂毒肽在机体内的半衰期很短，代谢速度很快，并不利于临床的疾病治疗。纳米运载体作为一种新型的给药方式正逐渐被人们所关注。利用纳米颗粒运载蜂毒肽是一种有效避免其毒副作用的方法。然而，目前使用纳米颗粒运载蜂毒肽的报道并不多见。有些研究学者尝试使用脂质体(liposome)对蜂毒肽进行运载，而电镜结果显示装载蜂毒肽后脂质体的结构会发生极大的改变，甚至有些会被降解掉。虽然在此基础上有学者提出了更加稳定的使用脂质体运载蜂毒肽的PEG修饰的盘形颗粒，但并没有真正应用于活体治疗。还有学者使用PLGA[poly (D, L-lactide-co-glycolide acid)]颗粒实现了对蜂毒肽的高包封率的运载，但是他们同样只是进行了体外的对比实验，并没有继续深入。运载蜂毒肽的其他一些纳米颗粒同样因为其溶血性质得不到改善而被大大限制。目前，有一种基于全氟化碳(perf luocarbon, PFC)纳米颗粒能够在活体动物中稳定运输蜂毒肽,在降低了其毒副作用的同时，能够有效地发挥抗肿瘤作用。此外，此蜂毒肽纳米颗粒在修饰了靶向基团后，还可以实现肿瘤的 特异性富集。但是这类PFC颗粒粒径较大，在200-300nm之间，无法穿越实体瘤内致密的网状胶原纤维的缝隙(20-40nm)，难以有效地扩散到肿瘤的内部，尤其是对血管不丰富的实体瘤，很难达到预期的治疗效果。而且PFC颗粒在人体内的代谢、排泄和生物毒性还需进一步实验验证；另外作为一种温室气体材料，全氟化碳的大量应用还会带来环境的破坏。因此，发展一种超小径粒(<40nm)的稳定运载蜂毒肽的纳米颗粒载药方法，有效地避免蜂毒肽的溶血性和对正常细胞的毒副作用，同时具有特异性富集在病变区域并有效释放蜂毒肽的能力，将会极大地促进蜂毒肽在临床疾病治疗中的应用。
发明内容
本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种运载蜂毒肽的多肽及其纳米颗粒、制备方法及其应用。利用运载蜂毒肽的多肽制备得到的纳米颗粒能够有效降低蜂毒肽对于机体的毒副作用，特异性地在肿瘤等疾变区域发挥作用，可以应用于临床治疗。本发明所采用的技术方案是:一种运载蜂毒肽的多肽，所述多肽是由α螺旋多肽、连接序列和蜂毒肽以共价键的形式串连而成。优选地，所述α螺旋多肽的氨基酸序列为DWFKAFYDKVAEKFKEAF。优选地，所述连接序列的氨基酸序列为GSG。一种运载蜂毒肽的纳米颗粒，所述纳米颗粒由权利要求要求I所述的运载蜂毒肽的多肽、磷脂、胆固醇脂三种有机结合的方式组成。优选地，所述憐脂为DMPC (I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，所述纳米颗粒能够有效降低蜂毒肽对于机体的毒副作用，特异性地在包括肿瘤在内的疾变区域发挥作用，可以应用于临床治疗。
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本发明具有以下优点:I)理化特性优良:利用动态激光光散射方法测得纳米颗粒的平均粒径为12nm左右，电镜结果显示，纳米颗粒的粒径均一、分散性好，无聚集现象。2)生物相容性好:制备该纳米颗粒所使用的原料为磷脂、胆固醇脂和运载蜂毒肽的多肽，这些原材料都已各自用于临床或临床试验，具有良好的生物相容性。3)制备工艺简单，便于规模化生产。4)药物包封率大于80%，符合《中华人民共和国药典》对于微囊制剂的要求；而相比于游离的蜂毒肽，采用运载蜂毒肽的多肽制备的运载蜂毒肽的纳米颗粒药物包封率提高了 18倍。5)治疗效果好:以实体瘤为例，运载蜂毒肽的纳米颗粒可以借助实体瘤的EPR效应(enhanced permeability and retention effect)在其内部富集,有效提高肿瘤区域的局部药物浓度，其超小的纳米尺寸可以自由地穿过实体瘤致密的网状胶原缝隙到达肿瘤核心部位，从而高效地杀伤肿瘤细胞，而且还可以有效避免肿瘤细胞的耐药性。6)毒副作用低:运载蜂毒肽的多肽设计可以增加其与磷脂之间的相互作用，使其埋藏在单层磷脂层当中，从而避免了与血细胞和正常细胞的直接接触。动物实验研究结果显示，运载蜂毒肽的纳米颗粒治疗组能够明显地抑制肿瘤的生长，且实验小鼠的血液生化指标与对照组之间无显著差异且都在正常值范围内。7)功能可扩展:运载蜂毒肽的纳米颗粒除了直接应用于肿瘤、风湿、血栓等疾病治疗外，还可以在其核心装载用于疾病诊疗的染料分子和药物分子，也可同时装载其它类型的靶向性多肽或治疗性多肽，实现疾病的协同靶向或协同治疗的功效。
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。图1 为 FPLC (Fast protein liquid chromatography)系统纯化小剂量制备的运载蜂毒肽的纳米颗粒时的双波段吸收-时间曲线图；图2为FPLC系统纯化运载蜂毒肽的纳米颗粒时的双波段吸收-时间曲线图；图3为FPLC系统纯化大剂量制备的运载蜂毒肽的纳米颗粒时的双波段吸收-时间曲线图；图4为FPLC系统纯化核心装载荧光染料DiR-BOA的运载蜂毒肽的纳米颗粒时的三波段吸收-时间曲线图；图5为FPLC系统纯化核心装载Flu0-BOA的运载蜂毒肽的纳米颗粒时的三波段吸收-时间曲线图；图6为使用动态激光光散射(DLS)系统测试运载蜂毒肽的纳米颗粒的纳米粒径结果; 图7为运载蜂毒肽的纳米颗粒的透射电子显微镜成像图像；图8为运载蜂毒肽的纳米颗粒与游离蜂毒肽的红细胞溶血性试验比较；图9为运载蜂毒肽的纳米颗粒与游离蜂毒肽对于各种肿瘤细胞的增殖抑制能力比较；图10为运载蜂毒肽的纳米颗粒抑制B16肿瘤在C57BL/6鼠体内生长的时间-肿瘤体积曲线图；图11为运载蜂毒肽的纳米颗粒抑制B 16肿瘤在C57BL/6鼠体内治疗第13天时治疗组与对照组小鼠体内剥离后的肿瘤块实物图；图12为运载蜂毒肽的纳米颗粒治疗荷B16肿瘤的鼠模型第13天时的血液生化和血细胞指标。
具体实施例方式实施例1运载蜂毒肽的多肽，该肽是由α螺旋多肽、连接序列和蜂毒肽以共价键的形式串连而成。本实施例中α螺旋多肽的氨基酸序列为:DWFKAFYDKVAEKFKEAF，连接序列的氨基酸序列为GSG，蜂毒肽的氨基酸序列为:GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ。该运载蜂毒肽的多肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID N0.1所述。制备运载蜂毒肽的纳米颗粒，其步骤为:I)将 3ymolDMPC(I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)>0.2 μ moI 胆固醇月旨(Cholesteryl oleate,简称C.0)的氯仿溶液在玻璃试管中充分混合,并用封口膜将试管口封死；2)在稳定的氮气流中将试管内的氯仿吹干，使步骤I)中的混合物能够在试管底部形成一层薄膜；3)将试管放入真空干燥器中真空干燥Ih ；
4)向试管中加入Iml的磷酸缓冲液，充入氮气密封后，利用涡旋震荡仪将试管底部的药品薄膜充分重悬形成均匀的乳白色的悬浊液；5 )将试管48 V超声Ih ；6)使用注射器向密封的试管中加入含有0.19 μ mol运载蜂毒肽的多肽的PBS溶液，混匀后密封，4 0C放置过夜。7)次日，使用FPLC系统纯化，收集有效溶液浓缩备用。运载蜂毒肽的纳米颗粒利用上述步骤进行合成，并使用FPLC系统对制备好的运载蜂毒肽的纳米颗粒进行纯化，其结果参照如图1至图3。图1为FPLC系统纯化小剂量制备的运载蜂毒肽的纳米颗粒时的双波段吸收-时间曲线图。使用0.19 μ mol运载蜂毒肽的多肽小量制备运载蜂毒肽的纳米颗粒。图1中显示的215nm吸收曲线值为实际值的1/5。图1中共出现3个峰，根据时间顺序分别定义为Peak 1、2、3 ;其中Peak 2为运载蜂毒肽的纳米颗粒，Peak 3为游离的多肽。Peak 2的积分面积占总面积的80.3%，而游离多肽含量(Peak 3面积)为8.74%。图2为FPLC系统纯化蜂毒肽纳米颗粒时的双波段吸收-时间曲线图。同时使用0.19 μ mol α -螺旋多肽和0.19 μ mol蜂毒肽小量制备蜂毒肽纳米颗粒。图中显示的215nm吸收曲线值为实际值的1/5。图2中的Peak 2的面积为4.22%，游离多肽含量为88.28%。实验结果表明，使用串联多肽的方法可以使蜂毒肽的运载率提高18倍，并有效提高多肽的利用率。图3为FPLC系统纯化大剂量制备的运载蜂毒肽的纳米颗粒时的双波段吸收-时间曲线图。使用1.9 μ mol运载蜂毒肽的多肽大量制备运载蜂毒肽的纳米颗粒。与图1所示的制备剂量同比放大10倍，图中显示的215nm吸收曲线值为实际值的1/5。)。图3中的Peak 2面积为79.5%，与小量制备的产率类似，表明该方法在放大过程中产率并未明显降低，可进行大规模的制备与纯化。作为运载蜂毒肽的纳米颗粒的扩展，在制备时也可在其核心内装载荧光染料。原料配比为:3 μ mol DMPC、0.Ιμπιο C.0,0.3 μ mol DiR-BOA (—种经过修饰的近红外荧光染料，激发和发射波长 分别为748nm和780nm)、0.57 μ mol运载蜂毒肽的多肽，其FPLC纯化结果参见图4，图4中显示的215nm吸收曲线值为原值的1/10。3 μ mol DMPC.0.1ymolC.0,0.3 μ mol Fluo-BOA (一种经过修饰的绿色荧光染料，激发和发射波长分别为495nm和525nm)、0.38 μ mol a -melittin，其FPLC纯化结果参加图5，图5中显示的215nm吸收曲线值为原值的1/10运载蜂毒肽的纳米颗粒基本性质的测定:纳米粒径的测量显示d=ll.76±2.40nm,其结果参见图6。透射电子显微镜照片参见图7，图7中显示出运载蜂毒肽的纳米颗粒是一种单分散性、粒径均一的纳米颗粒，没有明显的聚集现象。实施例2实施例1中制备得到的运载蜂毒肽的纳米颗粒与游离蜂毒肽对于溶血性能的比较参见图8。图8中显示运载蜂毒肽的纳米颗粒在蜂毒肽的浓度达到60 μ M的情况下溶血率仍然没有达到10%，而游离的蜂毒肽则在I μ M已经接近100%。证明运载蜂毒肽的纳米颗粒能够有效降低蜂毒肽的溶血性能，静脉注射后不会破坏红细胞，为其应用于活体治疗提供了基础。运载蜂毒肽的纳米颗粒与游离蜂毒肽在细胞杀伤能力方面的比较参照图9。通过图9和细胞增殖实验比较可以看出运载蜂毒肽的纳米颗粒可以降低蜂毒肽对于细胞的破坏，进而能够在活体应用过程中保护机体正常细胞免受侵害，有效降低蜂毒肽带来的毒副作用。实施例3实施例1中制备得到的运载蜂毒肽的纳米颗粒在体治疗肿瘤模型:构建B16皮下肿瘤模型。消化B16细胞，使用灭菌的PBS漂洗两次后进行细胞计数，最后将细胞浓度定为8 X IO6个/L。麻醉C57BL/6小鼠，将肿瘤细胞溶液注射至鼠左腿根部皮下，注射体积为100μ I。接种日期定为第O天，其后的日期分别记做第1、2、3……天。在第4天按照需求对鼠进行分层随机分组，每组建议数量不低于5只。在第5天时开始尾静脉注射。注射前先对各鼠进行标记，称取各鼠的质量，在预先制定好的表格中记录。Control组注射时只需尾静脉注射灭菌的PBS即可，注射量为0.2ml/10g。1.v.therapy组·需尾静脉注射a -melittin-NP,注射剂量为20mg/kg(多肽含量),注射体积为0.2ml/10g。1.p.therapy组需腹腔注射a -melittin-NP,注射剂量为20mg/kg(多肽含量)，注射体积为0.3ml/10g。NP Control组作为空载体对照，注射的浓度根据磷脂浓度来确定，磷脂浓度需要与Therapy组的磷脂浓度一致。注射周期为每隔一天注射一次，共4次。在第13天时取血化验并立即处死小鼠进行后续实验操作。使用游标卡尺来测定肿瘤体积。从第5天开始测量，每隔一天测一次，测量数据需及时记录在表格中。体积的计算公式为V=0.5XLXWXH。经过4轮治疗后显现出运载蜂毒肽的纳米颗粒的抑瘤率达到90%，与对照组相比具有显著的治疗效果。解剖后的肿瘤块对比也很明显地印证了这一效果。其结果参见图10和图11，图10中*代表P〈0.05。检测运载蜂毒肽的纳米颗粒治疗后小鼠的生理生化水平和血细胞指标，参加图
12。实验结果表明，运载蜂毒肽的纳米颗粒对小鼠的肝肾并未产生明显毒性，血细胞参数与对照差异不大，证实其良好的生物相容性。实施例4实施例1中制备得到的制备运载蜂毒肽的纳米颗粒的三类物质(磷脂、胆固醇油酸酯、多肽)都已经在临床上有应用。磷脂类物质已经应用于临床治疗，脂质体就是一个很好的例子。Doxil是一种用脂质体包裹阿霉素用来治疗卡波济氏肉瘤的药物，美国FDA已经批准Doxil用于卵巢癌和多发性骨髓瘤的治疗。胆固醇是人机体内本身存在的物质，具有很好的生物安全性。多肽类物质也有许多应用于临床治疗，举个例子:鹿瓜多肽就是一种很好的治疗骨折的药物。作为该药物主要成分的骨诱导多肽类生物因子可有效促进机体内影响骨形成和吸收的骨源性生长因子的合成。鹿瓜多肽注射液能明显促进骨愈合及新骨的形成，调节骨代谢，具有抗炎镇痛等作用，对骨折不愈合骨质疏松症疗效确切，无明显不良反应，对类风湿性关节炎软组织损伤疗效优良。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种运载蜂毒肽的多肽，其特征在于，所述多肽是由α螺旋多肽、连接序列和蜂毒肽以共价键的形式串连而成。
2.根据权利要求1所述的运载蜂毒肽的多肽，其特征在于，所述α螺旋多肽的氨基酸序列为 DWFKAFYDKVAEKFKEAF。
3.根据权利要求1所述的运载蜂毒肽的多肽，其特征在于，所述连接序列的氨基酸序列为GSG。
4.一种运载蜂毒肽的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒由权利要求要求I所述的运载蜂毒肽的多肽、磷脂、胆固醇脂三种有机结合的方式组成。
5.根据权利要求4所述的运载蜂毒肽的纳米颗粒，其特征在于，所述磷脂为DMPC(I, 2-dimyristoyl-sn -glycero-3-phosphocholine)。
6.一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，其特征在于，所述纳米颗粒能够有效降低蜂毒肽对于机体的毒副作用 ，特异性地在包括肿瘤在内的疾变区域发挥作用，可以应用于临床治疗。
全文摘要
本发明公开了一种运载蜂毒肽的多肽、运载蜂毒肽的纳米颗粒及其应用，属于生物科学和药物载体领域。所述肽是由α螺旋多肽、连接序列和蜂毒肽以共价键的形式串连而成；所述纳米颗粒由运载蜂毒肽的多肽、磷脂、胆固醇脂三种有机结合的方式组成。用运载蜂毒肽的多肽制备得到的纳米颗粒能够有效降低蜂毒肽对于机体的毒副作用，特异性地在肿瘤等疾变区域发挥作用，可以应用于临床治疗。
文档编号A61K9/14GK103073646SQ20121006456
公开日2013年5月1日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者骆清铭, 张智红, 黄川 申请人:华中科技大学