专利名称：鸡蛋膜胶原多肽的生产方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽技术领域，尤其是鸡蛋膜胶原多肽的生产方法，及其应用。
技术背景
鸡蛋壳作为人类生活的副产品大量存在，其内附着的鸡蛋壳膜尤其容易造成极大的污染环境。鸡蛋膜含有多种蛋白质(含量在90%左右)如胶原蛋白(I、V、X型)、骨桥蛋白、白蛋白、唾液蛋白等，还含有硫酸软骨素、透明质酸、N-乙酰氨基葡萄糖半乳糖、葡萄糖醛酸等，主要用于治疗和缓解关节痛等，是美容、保健品、化妆品、日化洗涤等上等原料。 鸡蛋膜蛋白在重金属离子选择性吸附材料、人造皮肤或皮肤治疗用敷料材料、酶固定载体、 细胞黏附生长基质或药物可控缓释材料等方面具有广泛的应用前景。
但是，鸡蛋膜不易大规模的从鸡蛋壳中分离出，目前还没有关于从鸡蛋膜生产多肽表面活性剂的报导。同时，鸡蛋膜含有大量的交联键而难以溶解，但是过强的不合适的处理条件会导致多肽过分降解，产品难于分离提纯。这些特性限制了鸡蛋膜的生产和应用。
尽管现有技术对蛋白质的酶解过程机理已经相当了解，出于不同原材料限制、不同产品的要求，新的处理过程往往需要专门开发出来以满足技术和经济要求。如
1、于淑娟等(齐齐哈尔轻工学院学报，1994，10(30) :30-35)用酸酶法水解玉米蛋白质制备复合氨基酸，即经酸作用后再加蛋白酶进行水解，此法可减少酸法和酶法两种方法的弊端，使产品中的氨基酸种类较齐全、含量较高、具有很强的溶解度和乳化能力，在提高产品的利用率的同时，减少污染物的排放。
2、王翠华等人(蛋白质类发泡剂的合成及其泡沫稳定性[J].南京工业大学学报， 2006,28(4) 92-96)采用牛蹄角为主要蛋白质原料，在适量氢氧化钙和少量NaHSO3存在的条件下水解，成功的合成蛋白质型泡沫混凝土用发泡剂。
3、卢珍华等(木瓜蛋白酶水解绿豆蛋白制备可溶性肽的研究[J]。食品科技， 2005,11 :56-58)研究木瓜蛋白酶对绿豆蛋白的水解作用。酶解的最佳条件为酶浓度8 % (E/S质量比)，底物浓度7% (绿豆蛋白与水的比)，反应温度65°C，反应时间!3h，pH6. 5，此工作开辟了植物蛋白新来源。
4、邓乾春等(白果活性蛋白的酶法水解及抗氧化活性研究[J]。农业工程学报， 2005,21 (11) =155-159)研究了酶法水解制备白果肽段的方法及其抗氧化活性的变化，通过单因素分析、正交试验以及对试验结果的分析，确定了碱性蛋白酶水解白果活性蛋白的最佳水解条件为底物浓度为1 %，pH值8. 5，水解温度45°C，酶浓度7000U. g_l，反应时间他。通过研究发现白果肽段的生物活性明显提高，为白果深加工研究及其新产品的开发打下了基础。
5、Pushkar Singh Bora(Functional properties of native and succinylated IentiKlens culiaris) globulins [J]. Food Chemistry, 2002, 77 :171-176)研宄了琥珀酰化后的和未酰化所得到的小扁豆球蛋白的性能，其中酰化后的小扁豆球蛋白的等电点从 4. 5变化到3. 5，提高了在pH大于4时的可溶性，亲水性，粘度有100%的提高，乳化性和乳化稳定性也有很大的提高，起泡性稍有降低。
6、冯光炷等人(复合氨基酸月桂醇脂的合成机性能[J]。郑州工程学院学报， 2003,24(4) :42-45)研究了以菜籽粕水解得到的复合氨基酸浓缩液为原料，与月桂醇酯化制得复合氨基酸月桂醇酯，确定了合成反应的最佳条件是月桂醇与复合氨基酸的摩尔比为 1 2，甲苯作带水剂(反应温度110 122°C)，反应时间为4h，催化剂浓H2SO4W量为复合氨基酸的8%，少量的聚乙二醇(PEG600)作相转移催化剂，制得的产品具有良好的泡沫稳定性，而且刺激性小、毒性低、降解性能好和降解产物毒性低等优良特性。
上述的这些例子清楚地说明每一类型的多肽产品常常有其相应的原料，相应的加工条件及工艺过程，也就是说，当前已经报导的多肽生产方法都不适用于从鸡蛋膜批量生产多肽或多肽表面活性剂。除受原料性能限制之外，现有技术在产品质量控制、可操作性、 能源耗费、特别是实现规模化、环境友好生产等方面都存在问题。发明内容
本发明针对不足，提出一种鸡蛋膜胶原多肽的生产方法，能大规模化生产，操作容易ο
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案一种鸡蛋膜胶原多肽的生产方法，包括以下步骤
①、从鸡蛋壳中取出鸡蛋膜，粉碎至40目以上；
②、将步骤①鸡蛋膜粉加入浓度为800 1000U/L的木瓜蛋白酶溶液中，固液比为 1 2 5，于；35 50°C搅拌2 3小时得混合料；
③、向步骤②混合料中加入NaOH溶液，至NaOH的质量浓度为2 4. 5%，于45 85°C搅拌3 4小时，静置；取上清液；
④、用稀盐酸调节步骤③得到的上清液pH值为7 11，得鸡蛋膜胶原多肽液；经脱盐、浓缩和干燥后，得到鸡蛋膜胶原多肽。
优选的，步骤④脱盐和浓缩是采用膜孔径为Ik的膜，干燥为180°C以下喷雾干燥。
优选的，步骤④脱盐是纯净水洗脱鸡蛋膜胶原多肽液至pH值为7 ；浓缩是采用膜孔径为300k的膜过滤；干燥为膜过滤后浓缩液180°C以下喷雾干燥或冷冻干燥。
优选的，膜过滤得到的滤过液采用膜孔径为30k的膜分离，得截流液和二次滤过液；所述截流液在温度180°C以下喷雾干燥；所述二次滤过液采用孔径为Ik膜浓缩，取浓缩液在温度180°C以下喷雾干燥。
一种如上所述生产方法制得的鸡蛋膜胶原多肽。
一种化妆品，包含有0. Olwt% 20wt%的鸡蛋膜胶原多肽。
优选的，鸡蛋膜胶原多肽含量为0. Iwt% IOwt%。
优选的，鸡蛋膜胶原多肽含量为0. Iwt% 5wt%。
与现有技术相比，本发明利用酶的高效性、专一性特点，对通常手段难降解的鸡蛋膜，在特定的温度和PH范围内进行高效生物降解，对降解的鸡蛋膜采用膜分离进行浓缩和纯化，实施规模化工业生产鸡蛋膜蛋白多肽。
本发明由于操作步骤以及条件简单，可规模化生产鸡蛋膜胶原多肽，能耗低同时不污染环境，以及能同时生产两种或两种以上的多肽表面活性剂，通过改变操作条件，多肽表面活性剂的性能可得到调节控制。
本发明首次报导了这些多肽表面活性剂的主要表面和界面特征。这些鸡蛋膜多肽表面活性剂是现时已知的蛋白质和多肽中降低表面张力能力最强的，在与传统表面活性剂形成的混合系统能进一步降低表面张力，这些混合系统能形成非常稳定的泡沫和乳化液， 其相对稳定性可通过多肽类型及混合体统组成进行调节。
作为天然多肽产品，配合采用的绿色生物降解及温和的膜分离提纯生产过程，利用鸡蛋膜生产所得到的多肽表面活性剂可替代从石油原料所生产的传统表面活性物质 (表面活性剂和表面活性聚合物或他们的混合物)，用于改进现有产品或复合新产品。天然多肽表面活性剂对皮肤和毛发的作用温和，有较强的亲和力和润湿效果，而且无毒、无刺激性，在洗涤的同时还能利于皮肤或毛发对多肽的吸收，特别适合皮肤过敏者及婴儿使用 (李异，朱海洋，李华山，等。N-脂肪酰基谷氨酸系表面活性剂在日用化学品中的应用[J]. 日用化学品科学，2003, ) :20-23)。
本研究工作显示，多肽表面活性剂在和少量的其他表面活性剂协调作用时具有更好的洗涤能力，纯天然鸡蛋膜多肽表面活性剂无毒、易于生物降解和吸收，符合人类绿色环保的要求。鸡蛋膜多肽表面活性剂在生物医药、药学、生物材料、化妆品和保健食品等中享有广阔的应用前景。
图1是产品C在不同的浓度下其表面张力随时间变化图2是产品D在不同的浓度下其表面张力随时间变化图3是产品C和SDS共吸附的表面张力对SDS的对数浓度作图；其中短肽浓度固定在0.1和1毫克/毫升。纯SDS的表面张力作为参考。所有实验均在纯水中进行，温度控制在22 23 °C ；
图4是产品C与SDS在氧化硅表面的共吸附。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
实施例1
取1000克新鲜鸡蛋壳，水冲洗除去异物，将壳粉碎去除其中的鸡蛋壳，然后把含有少量壳的鸡蛋膜配置好的蛋白酶溶液(200ml，浓度为800U/L)，设定温度在60°C，搅拌2 小时后，缓慢加入NaOH溶液，使得混合料中的NaOH的质量浓度为3%，温度65°C，搅拌3小时，静置。取上清液，用稀盐酸调节PH值到7得膜蛋白液，膜蛋白液的体积为原上清液的3 倍。采用Ik的膜装备脱盐浓缩，在温度180°C以下喷雾干燥，得鸡蛋膜胶原多肽产品A(大约37克)。
实施例2
取1000克新鲜鸡蛋壳，水冲洗除去异物，将壳粉碎去除其中的鸡蛋壳，然后把含有少量壳的鸡蛋膜配置好的蛋白酶溶液(200ml，浓度为1000U/L)，设定温度在35°C，搅拌3 小时后，缓慢加入NaOH溶液，使得混合料中的NaOH的质量浓度为3%，温度50°C，搅拌4小时，静置。取上清液，用稀盐酸调节PH值到9得膜蛋白液，膜蛋白液的体积为原上清液的3 倍。采用膜孔径为300k的膜过滤浓缩膜蛋白液，加纯净水洗脱溶液中的盐分使pH值回到 7,回收浓缩液和滤过液。将浓缩液在温度180°C以下采用喷雾干燥或冷冻干燥的方式，得鸡蛋膜胶原多肽产品B(大约2克)。
实施例3
将实施例2制备产品B所得到的滤过液，采用30k的膜进行分离，回收截流液和二次滤过液。将得到的截流液在温度180°C以下喷雾干燥，鸡蛋膜胶原多肽得产品C(大约15 克)。
实施例4
将实施例3制备产品C所得到的二次滤过液，采用孔径大小为Ik膜浓缩，取浓缩液在温度180°C以下喷雾干燥得产品D (大约22克)。
实施例5大量制备鸡蛋膜胶原多肽产品B，C和D
取200公斤新鲜鸡蛋壳，水冲洗除去异物，灭菌，压碎，参照如前所描述的步骤将壳粉碎去除，然后把含有少量壳的鸡蛋膜按比例加入配置好的蛋白酶溶液，再进行碱性深度溶解，酸中和，静置等待使用膜设置脱盐浓缩分离。采用的步骤与上述描述相同，但是清液量的增加通过按比例并联增分离加膜操作单元，适当调节系统操作平衡而达到脱盐浓缩及分离目标。经在温度180°C以下喷雾干燥得产品B大约410克，C大约3100克，D大约 4300 克。
产品组成分析
取产品B，C和D进行化学组成分析，结果显示
产品B含有88%有机物(氨基酸)，7%无机物(主要为钙盐)，5%水。
产品C含有75%有机物(氨基酸)，16%无机物(主要为钙盐)，7%水。
产品D含有82%有机物(氨基酸)，12%无机物(主要为钙盐)，6%水。
分析结果有3%左右的误差范围。
产品的性能检测实验
对上述实施例5制得的产品B，C和D进行性能检测，结果如下
1、水溶性
鸡蛋膜胶原多肽产品在水溶液中的溶解性较好，其中产品D (5kDa)比产品 C(40kDa)溶解性更好。升高温度有助产品C的增溶。
2、表面张力
2. 1、鸡蛋膜胶原多肽的表面张力
如图1和2所示的产品C和D在不同的浓度下其表面张力随时间变化。加入鸡蛋膜多肽在水溶液中能明显地降低表面张力。随着多肽浓度增加，降低表面张力能力越强。
结果表明产品C和D在刚开始的5 10分钟内具有相似的降低表面张力能力。在随后的5 10分钟里，表面张力趋于平稳。因此，20分钟时的表面张力可视为平衡值。可以清楚的看到即便是在最低浓度(0.03毫克/毫升)时，表面张力仍然比水要低得多。当浓度升高时，表面张力逐渐下降。在所研究的最高浓度为10毫克/毫升时，表面张力只有 30mN/m。
据我们所知，这是蛋白和短肽所能达到的最低的表面张力，Cooper等人[Adsorption of frog foam nest proteins at the air/water interface, Cooper, A.； Kennedy, M. W. ；Fleming, R. I. ；Wilson, E. H. ；Videlerm H. ；ffokosin, D. L. ；Su, Τ. J.； Green, R.J. ；Lu, J. R.，Biophys. J. 2005，88，2114-2125]曾利用表面张力仪和中子反射研究过不同蛋白的表面性质。结果表明青蛙巢穴蛋白之所以能够稳定巢穴泡沫是因为它是已知蛋白(如溶菌酶，牛血清蛋白，贝塔酪蛋白)中降低表面张力效果最好的。青蛙巢穴蛋白在1毫克/毫升时，表面张力约在50mN/m。相比而言，在相同的溶液条件下，产品C和D却可将表面张力降低到33mN/m和40mN/m，显示经过本发明加工处理的鸡蛋膜多肽具有最强的降低表面张力能力。
对大多数表面活性剂而言，在胶束浓度时的表面张力常在30mN/m(大多数非离子烷基表面活性剂，比如C12E5)到40mN/m(大多数离子表面活性剂，比如C12TAB和SDS)间变化。短肽表面活性剂具有和普通表面活性剂相似的减低表面张力的能力，因此可作为替代产品。同时短肽表面活性剂还具有石油表面活性剂无法比拟的性质如生物兼容性，可降解性和环境友好性。
在实际应用中，水溶液常含有盐分。此外，pH和温度也会变化。离子表面活性剂和非离子表面活性剂对环境的反应不同。比如，非离子表面活性剂C12E5对盐不敏感，但离子表面活性剂SDS对盐敏感，比如，向SDS中加氯化钠会降低胶束浓度使表面活性剂更有效。 相比之下，离子表面活性剂则对温度不敏感，但非离子表面活性剂却对温度敏感。加温会导致非离子表面活性剂C12E5降低胶束浓度。在极端条件下甚至会不溶。因此，在应用时要考虑到这些问题。
考察了 1毫克/毫升时溶液pH对多肽表面张力的影响。对于产品D(5kDa)来说， PH从5变到7时，对表面张力只有较小的影响。但升到8时，表面张力会上升5到10mN/m。 可能是因为溶解度上升导致的。对于产品C(40kDa)来说，pH从5变到8时，对表面张力的影响小于5mN/m。同时添加氯化钠并没有导致产品C和D的表面张力的明显改变。温度从 15到40°C对产品C的表面张力有影响，但对产品D没有太大影响。但温度对两者的影响并没有明显的趋势。总体来说，温度的影响大多数情况下小于5mN/m。
因此，和普通表面活性剂相比，鸡蛋膜胶原多肽表面活性剂对温度，pH和盐均相对不太敏感。这和蛋白和多肽的溶液性质相似，但和普通表面活性剂溶液性质不同。如此的环境稳定性对于其应用有重要的意义。比如，温度的不敏感性使得它们在食品的乳化及稳定(酸奶，冰激凌)，护理产品的乳化(面霜)方面有重要的应用。
2. 2、二元混合物(含表面活性剂及多肽活性剂)的表面张力
护理产品，食品和药品中常添加一些表面活性剂，聚合物和其他成分，以达到界面性能最最优化。因此，多肽表面活性剂可在此类产品中成为它们的替代品，或用于开发新的产品。技术上的问题在于多肽和其他产品能否相容和混合。
如图3所示，以纯SDS的表面张力作为参考，与文献报道结果一致，表明SDS样品的纯度很高。当有产品C存在时，表面张力变得低而比较平坦。因为纯的多肽在此浓度范围表面张力要高，说明在SDS和多肽二元混合物中两者互相作用起着主导作用。
当SDS浓度升高时，尽管最终效果是保持较低的表面张力，其分子在界面的结构和组成仍然不清楚。Green等人曾利用表面张力仪和中子反射研究过SDS-溶菌酶的界面结构禾口组成[Interaction of lysozyme and sodium dodecyl sulphate at the air-waterinterface, Green, R. J. ；Su, Τ. J. ；Joy, H. ；Lu, J. R. , Langmuir 2000,16,5797-5805·]。他们在聚集浓度以下发现一个清晰的表面张力峰。在低于或高于这个峰的情况下，表面张力保持稳定。虽然表面张力看似稳定，但是中子反射实验的结果表明其界面的结构和组成却变化很大。因此，表面张力这时并不能给予过多的界面信息。但两种技术联合使用却能反映比较详细的界面变化过程。他们指出在低SDS浓度时，电中和起到主导作用。亲油作用在形成SDS-蛋白胶束也起到一定作用，使球状蛋白结构变形。表面张力的上升与蛋白结构的变形和溶解同时进行，随后的表面张力降低与SDS在界面竞争吸附起主导作用有关。Taylor 等)κ [Taylor, D. J. F. ；Thomas, R. K. ；Hines, J. D. et al. ， Langmuir 2002,8,9783-9791] 曾研究过带正电的表面活性剂CnTAB和带负电的聚合物PSS 二元混合物的表面吸附。与 SDS-溶菌酶系统相似，他们同样也观察到了在胶束临界浓度下表面张力峰的出现，意味着在这些条件下沉淀物的形成及伴随的张力升高。
与SDS-溶菌酶系统相比，膜多肽活性剂的表面张力相当平稳，表明其界面结构和组成匹配更佳。应该注意的是溶菌酶带正电，相比而言，短肽活性剂的等电点在PH4 5之间，在PH5 8之间和SDS带电性相同。因此，在这样的体系里电荷中和所造成的附着及其后的沉淀所带来的表面张力峰值不会出现。
当有产品D与SDS混合时，其二组分系统表面张力随SDS浓度的变化同样比较平坦，且表面张力随多肽活性剂的浓度升高而下跌，这些基本现象与SDS和多肽产品C的二元混合物体系基本上类似，说明界面行为受两者互相作用所控制，就是说，在很大的SDS和多肽组分范围内，界面准是含有两组分，两者相互作用起着主导作用。
鉴于上述的分析，同样考察了产品C和D在相同条件下与阳离子C12TAB混合后的表面张力情况。我们发现表面张力结果与SDS-膜多肽系统相似。也就是在C12TAB胶束浓度以下几乎是平坦的曲线。短肽浓度在1毫克/毫升时，产品C与C12TAB混合物表面张力只有30mN/m。表面张力峰的消失和低表面张力也是其两个重要特征。这些结果显示异电作用所造成的表面张力峰及伴随的沉淀在我们的活性肽体系中不会发生，显示静电相互作用不起主要作用。这为活性多肽在稳定泡沫及乳化液过程中提供了独特的性能。
3、泡沫稳定性
3. 1、多肽活性剂的泡沫稳定性
低表面张力和高泡沫稳定性是相关联的，不过并不是所有的低表面张力都能产生高泡沫稳定性。在了解多肽活性剂系统性能后，取决于实际应用情况，可对系统稳定性进行调整。在下面的试验中，将不同的蛋白溶解在水中。浓度均为1毫克/毫升。将试剂瓶同样震荡1分钟。静置2分钟后，多肽产品D泡沫仍然很稳定，与贝塔酪蛋白(beta-casein) 的泡沫类似，并好于牛血清蛋白(BSA)。相比而言，溶菌酶(chicken egg white lysozyme), 产品C的泡沫减少很多，其稳定性相对差。
3. 2、多肽活性剂含有SDS的泡沫稳定性
1毫克/毫升的贝塔酪蛋白，产品D (5kDa)，牛血清蛋白，产品C (40kDa)，溶菌酶中加入 0. 2mM SDS。
将试剂瓶同样震荡1分钟。静置2分钟后，拍照。产品C也一样形成不稳定泡沫， 但由牛血清蛋白和溶菌酶所成形的泡沫的稳定性却变得相反了。
结果同时显示，改变SDS和多肽活性剂各自浓度能改变泡沫的稳定性，就是说，混合体系泡沫的稳定性和不稳定性可以通过选择不同的多肽活性剂类型、浓度等条件来控制。不难想象，泡沫稳定性和不稳定性也可以通过其它条件，活性剂、盐、其它添加剂的种类、浓度等调节。说明在实际应用中可根据产品使用要求，通过组分来控制泡沫的稳定性和不稳定性，如使洁面水不需要稳定泡沫出现，但是发乳却一般需要有少许稳定性，而食品泡沫常常要求很好的稳定性。
按照如上描述的原理，通过与阳离子、非离子及其它生物的或合成的界面活性材料(天然表面活性剂，改性纤维素，聚丙烯酰胺)复合，鸡蛋膜多肽可调节泡沫的稳定性及不稳定性，取决于用法。
4、乳化稳定性
4. 1、多肽活性剂的乳化稳定性
在研究乳状液稳定性中，水溶液组成维持与上述泡沫系统相同，与正己烷1比1混合后，将试剂瓶同样震荡1分钟。静置2分钟后，拍照。图十一结果显示产品D的乳化效果好于贝塔酪蛋白(beta-casein)，牛血清蛋白(BSA)和溶菌酶(Iysozyme) 0产品C的稳定性能也最弱，此趋势与泡沫稳定性相同。
4. 2、多肽活性剂在加入SDS后的乳化稳定性
在纯蛋白质乳化液稳定性实验的基础上，在每一个试样里加入0. 2mMSDS，再与正己烷1比1混合。将试剂瓶同样震荡1分钟。静置2分钟后，拍照。结果与多肽活性剂加入 SDS后的泡沫稳定性类似，表明加入少量表面活性剂确实可调节表面张力，影响界面分子结构及泡沫的稳定性。产品C和D的相对稳定性与不加SDS相同，但是加入SDS可调节稳定性。进一步的实验显示，乳化液的稳定性可通过调节多肽和SDS浓度来控制。类似地，调节多肽表面活性剂的类型及溶剂性能都能达到控制乳化液稳定性的目的，这一性能对控制以乳化液为基础的产品稳定性有很强的指导意义。
5、选择性吸附
以下实验的目的在于表明多肽在固体表面的吸附能力。如图4所示，实验pH在 6. 5 7之间，温度在22 23°C。表面吸附量由椭圆光度仪测量。60分钟后，溶液被取出， 并放入同样量的水，并继续测量。由于溶液浓度的降低，升起的吸附由活性肽引起。
多肽活性剂在许多介质表面都有很强的吸附，这从表面接触角的变化可容易确定。同时，吸附了的多肽活性剂不易用水或缓冲液冲洗掉，显示其很强的不可逆性。
氧化硅表面亲水并带弱负电，与头发类似。因此SDS在表面不吸附。相反，多肽由于熵的作用会在表面吸附。因此，增加SDS浓度会抑制多肽在表面吸附。在SDS浓度为5mM 时，多肽不再吸附。然而，在溶液稀释或清洗时，由于SDS浓度急剧下降，其影响力减小。相比而言，多肽在表面吸附与浓度关系不大，导致多肽在表面吸附。因此，多肽在表面的吸附能够通过混合物比例来调节。结果同时表明多肽具有较强的表面活性，条件合适时可以通过冲洗在表面吸附。
根据上述对本申请生产方法制得的鸡蛋膜胶原多肽产品的性能分析，说明该产品能有效地降低表面张力。与表面活性剂及其它组分在混合使用时良好的配伍性。鸡蛋膜多肽在固体界面吸附能力也很强。与其它表面活性物质混合后，系统性能随其组分灵活变化， 这些性能已经通过与模型表面活性剂系统混合而显示出来。这些独特的功能说明鸡蛋膜多肽能非常灵活地与不同的表面活性剂复合成不同的产品，在食品，个人护理，制药，生物传感器和其他生物技术方面具有广泛的应用前景。
因此，本发明把这些胶原多肽用作为表面活性物质或多肽活性剂，可用于各种各样的产品及生产过程，起到降低表面张力、润湿、清洁、分散、乳化、起泡、反泡作用。例如，胶原多肽表面活性剂可以用于清洁产品包括清洁剂，织物柔和剂，农产品保护剂包括除草剂， 杀虫药剂，个人卫生护理包括洗发香波，面霜，合成乳化液如涂料，粘合剂，墨水，药物。
因为所特有的生物兼容性、可降解性，通过上述方法生产的鸡蛋膜降解物系列产品也可用于细胞培养基原料、人造皮肤和皮肤治疗用辅助材料、酶固定用载体材料、治疗和缓解关节痛主要原料、保健食品原料、化妆品原料(包括头发皮肤护理)、日化洗涤用原料等。取决于不同的应用过程及机理，鸡蛋膜降解物系列多肽产品中的一或几个产品可独立使用或按不同的方法及组分进行复合，所得产品可以液态，粉剂，胶化体，泡沫，乳化液或乳脂类型出现，如洗面水，面霜，乳液，药膏，牙膏，除臭喷雾剂。
本发明所要求的生产及产品包括所有含有鸡蛋膜降解活性多肽或多肽活性剂产品，其中多肽活性剂产品含量通常在0. Olwt % 20wt %之间，在大部分产品中其含量在 0. lwt% 10wt%之间，或在0. lwt% 5wt%之间。这些生产过程和产品(如洗面水，面霜， 防皮肤老化霜，乳液，药膏，牙膏，除臭喷雾剂)中经常含有含量通常在0.01Wt%-15Wt%之间的如下物质
1、维生素包括A，B, C，D，E，K系列和它们的派生物，视黄醇(维生素A)化合物包括C2-C22视黄醇酯，维生素A棕榈酸酯，维生素A醋酸，丙酸维生素A，视黄酸；
2、水杨酸化合物(酯类和盐类)；包括β -sitosterols, lupenol，豆留醇，植物甾醇，
3、取代的和未取代的黄酮类化合物，包括黄酮类，香豆素，chromanols (例如，大豆黄酮(7，4' - 二羟基异黄酮))，
4、天然的和取代的氨基酸，如N-酰基苯丙氨酸(天然氨基酸，乙酰氨基酸，甲基氨基酸，N-undecylenoy 1-L-phenylalanine, N-十四烧基赖氨酸),
5、设计和仿生物的短肽，包括二肽、三肽、四肽、五肽、六肽等，如Val-Trp， Asp-Phe, Ala-His, Arg-Lys-Arg, His-Gly-Gly, Gly-His-Lys, Gly-Gly-His, Gly-His-Gly, Lys-Phe-Lys, Gly-Gln—Pro—Arg, lipopeptides such as N-PalmitoyIAla-His, N-Palmitoyl-GlyLys-His andN-Palmitoyl-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser, N-Palmitoyl-Tyr-Gly -Gly-Phe-Xwith X denoting Met or Leu，N-Palmitoyl-Val-Gly-Val-Ala-Pro_Gly等(由 Sederma and其它公司供给)，
6、颗粒状材料添加剂包括有色和无色颜料，有机和无机粉末，粘度增强和荧光增白粒子和它们在不同形状和组分下的组合，如玻璃，氧化锌，氧化硅，蚕丝，多孔或无孔的微粒材料，其他地球矿物，如三氧化二铝和粘土，硅共聚物，聚苯乙烯衍生物，这些颗粒或许具有涂层，
7、防晒霜活性成分，包括有机和无机的抗UV-A和UV-B化合物，如对氨基苯甲酸衍生物，乙基-PABA的衍生物，肉桂衍生物，乙基己基水杨酸，methoxydibenzoylmethane 丁酯，乙基己基三嗪酮，二苯甲酮-3苯基苯并咪唑，
8、局部麻醉剂，包括苯佐卡因，利多卡因，布比卡因，chlorprocaine，dibucaine, 氯胺酮，普鲁卡因和丁卡，
9、粉刺活性成分，包括过氧化苯甲酰，脱氢乙酸，锌，硫，间苯二酚，红霉素，水杨酸，
10、保湿和调理剂，包括尿素，胍，乙醇酸盐，烷基胺盐，乳酸，多羟基醇，如山梨醇， 甘露醇，木糖醇，甘油，丙二醇，聚乙二醇，糖，淀粉及其衍生物，透明质酸，烷基糖和淀粉酯， 合成水溶性的非离子型和离子聚合物，如改性的聚乙二醇和聚丙烯乙二醇，
11、消炎药，包括皮质类固醇，如氢化可的松，吡罗昔康，阿司匹林，布洛芬及衍生物，从天然来源(植物，真菌，微生物)提取的此类物质，
12、晒黑活性物质，包括dihydr0aCet0ne(DHA或1，3_ 二羟基-2-丙酮)，
13、美白剂，包括曲酸，氢醌，氨基酚衍生物(N-胆固醇氧羰基对氨基酚等，
14、抗菌药物，包括煤焦油，硫磺，三氯化铝，trichlosan，茶树油，丁香叶油， thiobendazole，多烯，hydroxypyridone，过氧化苯甲酰，3_羟基苯甲酸，苯并咪唑，
15、增稠和胶凝剂，包括羧酸聚合物，交联聚丙烯酸酯聚合物，聚丙烯酰胺聚合物， 如羧甲基羟乙基纤维素多糖，醋酸纤维素丙酸羧酸，羟丙基纤维素，微晶纤维素，钠纤维素硫酸和它们的混合物，
16、表面活性剂，包括阴离子(十二烷基硫酸盐及衍生物)，阳离子(十六烷基三甲基氯化铵及衍生物)，非离子型(Triton系列)和两性表面活性剂(天然或合成的类脂及其衍生物)，
17、阳离子、阴离子、非离子和两性聚合物及其共聚物，
18、头发和皮肤调理剂，包括任何改进头发、皮肤光泽，柔软性，兼容性，身体，抗静电性能，损坏，油腻的材料。这些材料通常不溶于水，但是可水分散，做成分散或乳化液，包括有机硅(硅油，阳离子有机硅，有机硅牙龈，高折射率有机硅，碳氢油类等组分，
19、去屑活性成分包括pyridinethione盐，唑类，硒氯和硫。
使用本发明实施例1至4的鸡蛋膜胶原多肽，分别制得如下的各种化妆品
实施例6护发素
￠( 2wt%$MM 4 ^zfeBnn3wt% Incroquat Behenyl TMC (Behentrionium 氯，鲸蜡硬脂醇)，1 %苯基trimethiocone，0. 2wt %的防腐剂，0. 1 %山梨酸钾，2wt % PROCAPIL (含有PPG16-Butech-25，丁烯乙二醇，少量水，PEG-40氢化蓖麻油，芹菜素， 齐墩果酸和 Biotinyl 三肽-1),0. 1%,香水，0. 025wt % sarcolactic 酸，水达到 IOOwt %。 乳液轻轻擦拭，能促进在真皮的休止期毛发再生。
实施例7抗皱霜与皮肤美白
取2wt% 实施例 4 的产品 D，掺加 0. Iwt % Ultrez 10 (卡波姆)，3wt% transcutol， 8wt% 甘油，0. 1 % 山梨酸钾，0.6wt% Volpo S2 (Steareth 2) ,4wt % Crodafos CES (鲸蜡硬脂醇，双十六烷基磷酸，磷酸盐 ceteth 10)，2wt % DC344 (cyclomethicone)，IOwt % CR0DAM0L GTCC(辛酸/癸甘油三酯)，1. 6wt% CrUl 3(山梨醇硬脂酸),0. 3wt%混合苯甲酸酯，0. 3wt% WNaOH(30% ),3000 Matr i ixyl 3WT% (甘油，丁烯乙二醇，水，卡波姆， 聚山梨酯20，棕榈酰寡肽，棕榈四肽Uwt %LUMISKXN (辛酸/癸甘油三酯，双乙酰 bo 1 dine) ,0. 1%的清香，水，达到IOOwt %。此肽复合体抗皱霜是适合皮肤美容治疗，包括鱼尾纹，皱纹，色素沉着斑，刺激排毒系统。
实施例8身体乳液
取2wt%实施例4的产品D，掺力0. 3 1%柠檬酸，1. 2wt %柠檬酸trisodique， 10wt% alcool，0. 2wt%的甲基苯，Volpo G 26(glycereth 26), Crillet 1(聚山梨醇酯20) ,0. 1%的香水。此乳液滋润，保湿，提供放松的感觉和青春外观。
实施例9天然沐浴露
配方1杯(50毫升)水，玉米淀粉1茶匙(5毫升)，2汤匙甘油(20毫升)，1茶匙蔗糖，2汤匙产品D胶原蛋白多肽粉O克)，5 10滴的自然香味油(柠檬或桔子)，1 2 滴的红色或黄色的食用色素(可选)，放置在一个碗或烧杯中，混合所有成分。倒入成挤压瓶，在48小时内使用。需要较长期使用，添加防腐剂。
实施例10细胞生长对照
上述实施例6 9使用天然鸡蛋多肽表面活性剂代替传统表面活性剂和共聚物表面，以期改进产品对皮肤的生物配伍性。本例子通过皮肤细胞实验显示这一优势。
(1) f^A^itMM (HEKa, > 25population doublings, from Invitrogen)才直入 M孔培养板，使用中-低葡萄糖的DMEM-LG培养媒质(Dulbecco' s modified Eagle' s medium-low glucose)增补 10%牛血清(fetal bovine serum，FBS)，Iwt %青霉素-链霉素 (from Sigma)，每孔细胞数大约为5. 0 X 104，安置在37°C，湿空气与5% CO2下培养3天，然后除去旧的培养媒质。新的培养媒质分加和不加FBS，分别添入0，0.5，1，2和5%的多肽表面活性剂D，SDS, C12TAB, C12E5，非离子聚合物PluronicF-127。使用倒置相显微镜观察细胞生长数量形态，并用标准MTT化验检查细胞生存能力。每组包含3次重复。
观察结果
(i)加入离子表面活性剂SDS和C12TAB引起细胞在1到数小时内表面脱附、死亡， 离子表面活性剂浓度越高，此现象出现越快。相比之下，非离子表面活性剂负作用在低浓度下不明显，但是高浓度似乎弓I起缓慢凋亡。
(ii)加入多肽表面活性剂明显促进细胞增长，浓度越高，增长越快。在2和5%多肽D下的增长几乎与10% FBS 一样。
(iii)在未加多肽表面活性剂或FBS的情况下，细胞成长缓慢或逐渐几乎无增长。
(2)成人皮肤成纤维细胞(HDF，> 25 population doublings, fromlnvitrogen) 用于重复上面细胞生长实验，观察与上基本一致。
(3)使用多肽表面活性剂C重复上面细胞生长实验，观察与上基本一致。
以上细胞生长对比实验因而明显显示(1)多肽表面活性剂对皮肤细胞无毒性、 具有很好的生物配伍性，( 能促进皮肤细胞生长。相比之下，传统表面活性剂具有不同程度的毒性，不能作为有效的皮肤细胞营养物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种鸡蛋膜胶原多肽的生产方法，包括以下步骤①、从鸡蛋壳中取出鸡蛋膜，粉碎至40目以上；②、将步骤①鸡蛋膜粉加入浓度为800 1000U/L的木瓜蛋白酶溶液中，固液比为 1 2 5，于；35 50°C搅拌2 3小时得混合料；③、向步骤②混合料中加入NaOH溶液，至NaOH的质量浓度为2 4.5%，于45 85°C 搅拌3 4小时，静置；取上清液；④、用稀盐酸调节步骤③得到的上清液PH值为7 11，得鸡蛋膜胶原多肽液；经脱盐、 浓缩和干燥后，得到鸡蛋膜胶原多肽。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤④脱盐和浓缩是采用膜孔径为Ik 的膜，干燥为180°C以下喷雾干燥。
3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤④脱盐是纯净水洗脱鸡蛋膜胶原多肽液至PH值为7 ；浓缩是采用膜孔径为300k的膜过滤；干燥为膜过滤后浓缩液180°C以下喷雾干燥或冷冻干燥。
4.如权利要求3所述的生产方法，其特征在于膜过滤得到的滤过液采用膜孔径为30k 的膜分离，得截流液和二次滤过液；所述截流液在温度180°C以下喷雾干燥；所述二次滤过液采用孔径为Ik膜浓缩，取浓缩液在温度180°C以下喷雾干燥。
5.一种如权利要求1 4任一所述生产方法制得的鸡蛋膜胶原多肽。
6.一种化妆品，包含有0. Olwt% 20wt%的鸡蛋膜胶原多肽。
7.如权利要求6所述的化妆品，其特征在于鸡蛋膜胶原多肽含量为0.Iwt % IOwt %。
8.如权利要求7所述的化妆品，其特征在于鸡蛋膜胶原多肽含量为0.Iwt % 5wt%。
全文摘要
本发明公开了一种鸡蛋膜胶原多肽的生产方法，包括以下步骤①从鸡蛋壳中取出鸡蛋膜，粉碎至40目以上；②将步骤①鸡蛋膜粉加入浓度为800～1000U/L的木瓜蛋白酶溶液中，固液比为1∶2～5，于35～50℃搅拌2～3小时得混合料；③向步骤②混合料中加入NaOH溶液，至NaOH的质量浓度为2～4.5％，于45～85℃搅拌3～4小时，静置；取上清液；④用稀盐酸调节步骤③得到的上清液pH值为7～11，得鸡蛋膜胶原多肽液；经脱盐、浓缩和干燥后，得到鸡蛋膜胶原多肽。本发明操作步骤以及条件简单，可规模化生产鸡蛋膜胶原多肽，能耗低同时不污染环境，以及能同时生产两种或两种以上的多肽表面活性剂，通过改变操作条件，多肽表面活性剂的性能可得到调节控制。
文档编号A61K8/65GK102517363SQ20111036313
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者吕军仁 申请人:淮安鸿玛生物科技有限公司