专利名称：用以活化血小板的添加剂的制作方法
技术领域：
本发明关于一种用于血液样本的添加剂，尤指一种用于活化血小板的添加剂。
背景技术：
凝血作用是人体一个重要的急救措施，凝血机制分为外源性(extrinsic)与内源性(intrinsic)，牵涉多层的调控及各种凝血因子，其中血小板和钙离子(Ca2+)扮演极重要的角色，血小板调控内源性凝血机制，钙离子则为多种凝血因子的辅因子，因此在创伤时，血小板会产生多种生长因子，进而促进凝血及伤口愈合。富血小板血浆(Platelet Rich Plasma, PRP)在特定pH值及血小板浓度下可产生多种生长因子，因此医学上将其用于治疗糖尿病患者难以痊愈的伤口、关节炎、足部溃烂或是烧烫烧等，甚至也能配合植皮促使组织细胞再生修复，效用佳且副作用低。PRP于使用上的效果除了依不同治疗有不同导入方式外，影响其活性最大者便是PRP中血小板的浓度与其活性，较高浓度或活性较高的血小板产生的生长因子较多，治疗的效果越快也越好，虽应用PRP治疗的疾病多非急症，但若能提高每次施打PRP的效力，便可减少抽血与治疗的次数，不仅降低感染的机率、节省人力物力及减轻病患的痛楚，因此如何有效率地使PRP产生更多生长因子，确有其开发的必要性。
发明内容
本发明的一目的为提供一种活化血小板的方法，其可提升现有治疗方法之的效力，有助于提升医疗质量。本发明又一目的为提供一种用于血液样本的添加剂，可活化血液样本中的血小板，使其产生较多量的生长 因子，以获得较佳的治疗效果。为达到上述目的，本发明提供一种用以活化血小板的添加剂，其包含钙离子、抗氧化剂、抗生素和缓冲液。较佳地，前述钙离子的浓度范围为0.05、.5mEq/ml。较佳地，前述抗氧化剂的浓度范围为10(T400mg/ml ;较佳地，前述抗氧化剂为谷
胱甘肽、维生素C、维生素E、维生素A、类胡萝卜素、辅酶、硫辛酸、类黄酮或其组合。较佳地,前述抗生素的浓度范围为2(Γ70 μ g/ml ;较佳地,前述抗生素为硫酸正泰霉素、链霉素、林可霉素、青霉素、四环霉素、氯霉素、红霉素、磺胺类药或其组合。较佳地，前述缓冲液系医药可接受的缓冲液；较佳地，前述缓冲液为磷酸缓冲溶液、林格氏溶液或其组合。本发明又提供一种活化血液样本的方法，其步骤为将样本与添加剂混合。较佳地，前述混合时间为5 20分钟。较佳地，前述样本为血浆，每毫升含有10(Γ300Χ106的血小板。较佳地,前述样本为富含有血小板的血衆(PRP)，其含有浓度超过每毫升109的血小板。
综上所述，本发明的添加剂除添加活化血小板必需的钙离子外，更辅以抗氧化剂及抗生素，增加PRP使用上的持续性及安全性，因此有助于PRP于临床上的应用。此外，本发明的添加剂只需简单与血液样本(如，PRP)混合，即可发生效果，不论在检测性、治疗性或美容性的临床运用上，都具有简便快速的优点。
图1为本发明实施例一于活化血小板的试验结果。
具体实施例方式本发明关于一种用以活化血小板的添加剂及使用前述添加剂于检测性、治疗性或美容性的临床运用上活化血小板的方法。前述添加剂包含适当浓度的钙离子、抗氧化剂、抗生素及缓冲液。本发明所称的「活化」系指使增加血小板的生理活性及/或促进其于生理机制上的功能。举例来说，如促使血小板更有效率地释放生长因子如血小板衍生性生长因子(TOGF-BB)、转化生长因子(TGF-β)与血管内皮生长因子(VEGF)。本发明所称的「血液样本」泛指人类或动物的血液样本；更明确地，系指富含有血小板的血浆样本。然而，所属领域具有通常知识者，参本发明说明书所揭露的内容，当可理解使用本发明的添加剂使任何血液样本中所含的血小板活化，皆应属于本发明的范畴。前述钙离子的浓度为0.05、.5mEq/ml。前述钙离子可由含钙离子溶液来提供，其包括，但不限于氯化钙溶液、磷酸钙溶液、钙葡糖酸盐或其组合。由于钙离子是血小板活化路径中重要辅因子(cofactor)，因此，添加钙离子将有助于促使血液样本中的血小板活化，或提供其活化的程度。前述抗氧化剂的浓度为10(T400mg/ml。前述抗氧化剂包括，但不限于谷胱甘肽、维
生素C、维生素E、维生素A、类胡萝卜素、辅酶、硫辛酸、类黄酮或其组合。于本发明的添加剂中添加抗氧化剂可去除自由基等活性物质，延长生长因子的寿命。前述抗生素的浓度为2(Γ70 μ g/ml。前述抗生素包括，但不限于硫酸正泰霉素、链霉素、林可霉素、青霉素、四环霉素、氯霉素、红霉素、磺胺类药或其组合。于本发明的添加剂中添加抗生素可避免在使用血浆样本时可能发生的感染。前述缓冲液于本发明的添加剂中系为了维持适当pH值环境，使血液样本中的血小板维持正常的生理活性，而得以持续释放生长因子。较佳地，前述缓冲液系将本发明的添加剂的PH值控制于51之间。更明确地，前述缓冲液为医药可接受的缓冲液，包括，但不限于:林格氏溶液、磷酸缓冲液或其组合。本发明的添加剂的配制方法系简述如下:首先，取得所需的原料，包括欲使用的含钙离子溶液、抗氧化剂、抗生素及缓冲液。前述原料可直接选购商业上经无菌处理的医药级试剂，或者亦可简易经实验室调 配，再依所属领域中具有通常知识者所习知的方式来灭菌。举例来说，灭菌的方式有:经0.22μπι的圆形滤膜(俗称小飞碟)过滤以同时达到滤除细小杂质及灭菌的效果，或者亦可使配好的试剂于灭菌釜中经高温高压灭菌。值得注意的是，部分药剂并不适合以高温高压的方式来灭菌，例如，在这样的温度压力条件下，很有可能造成抗生素的破坏，因此所属领域具有通常知识者当可理解需视情况选择采用灭菌的方式。较佳地，即便所使用的原料是在供货商端便已灭菌过的产品，或已经操作者进行灭菌，于本发明的添加剂配置完成后，仍可再经过至少一次的0.22 μ m圆形滤膜过滤，以避免于制备本发明的添加剂的过程中的任何可能污染情况。取得所需原料之后，陆续将前述含钙离子溶液、前述抗氧化剂及前述抗生素加入前述缓冲液中，其混合的顺序并没有限制，但为了维持前述抗氧化剂与前述抗生素的活性，较佳地，系先混合前述含钙离子溶液与前述缓冲液。除此之外，亦可将前述含钙离子溶液与前述缓冲液混合为一混合液之后，将前述混合液妥善保存，直至需要使用本发明的添加剂时，再将保存的前述混合液取出，并添加前述抗氧化剂与前述抗生素。如此一来可以确保氧化剂与抗生素的活性维持在最佳的状况。将前述含钙离子溶液、前述抗氧化剂及前述抗生素加入前述缓冲液中后，搅拌或摇晃使所有成分能均匀的混合。较佳地，为了维持前述抗氧化剂与前述抗生素的活性，于室温下进行混合程序；更明确地，于16 26°C下进行混合程序。完成混合程序之后，如前所述，较佳地系再经过至少一次的0.22 μ m圆形滤膜过滤，便制得本发明的添加剂。于使用本发明的添加剂时，较佳地，将前述添加剂与血液样本进行混合。更明确地，混合过程需持续摇晃以使前述添加剂与血浆样本充分地混合。较佳地，前述混合的时间为5 20分钟。据此，本发明的添加剂提供血小板活化所需的辅因子，且血浆样本来自病患本身，因此不会有免疫排斥的问题，特别适合使用生长因子促进组织新生的医疗。以下实施例仅以文字并搭配图式说明实际进行的制程及实验，以使所属领域中具有通常知识者更明确地了解本发明的特点与精神。惟需注意的是，以下实施例仅用于示范性地说明本发明，而不应用以限制本发明的权利范围。实施例一:制备本发明的用于活化血小板的添加剂。于本实施例中将 示范性地制备本发明的添加剂。取得无菌的缓冲液、含钙离子溶液、抗氧化剂及抗生素。于本实施例中，所使用的缓冲液为林格氏液、所使用的含钙离子溶液为氯化钙溶液、所使用的抗氧化剂为谷胱甘肽及所使用的抗生素为硫酸正泰霉素。首先，将1.7 mL的林格氏液与0.5 ml的氯化钙溶液(0.272 mEq/ml)混合，再于20°C的条件下加入250 mg的谷胱甘肽与4 μ I的硫酸正泰霉素(50 μ g/ml)。待各成份均匀混合及溶解至无悬浮物为止，即可获得本实施例的用于活化血小板的添加剂，其中钙离子浓度约为0.062 mEq/ml、谷胱甘肽的浓度约为113.636 mg/ml及硫酸正泰霉素的浓度约为 45 μ g/mlο实施例二:实施例一的添加剂的使用方法及效果分析。于本实施例中，将实施例一的添加剂与血浆样本依实际使用情况混合后，分析添加剂的效果。前述血浆样本为富含血小板血浆(PRP),其来源为自人体抽取的全血,经离心等技术纯化而得，其血小板浓度每毫升超过109。将富含血小板血浆(PRP)与实施例一所制得的添加剂直接于室温下混合，其中持续以手或振荡器摇晃，以使两者充分混匀后，使其静置20分钟，再测定其中的血小板衍生性生长因子(H)GF-BB)、转化生长因子(TGF-β)与血管内皮生长因子(VEGF)的浓度。请参考图1，其显示加入添加剂后前述三种生长因子的浓度均较全血的生长因子浓度有显著的提高。 由图中的数据可知，与对照组相比，实施例一的添加剂可提升血小板衍生性生长因子约3.5倍的释放，提升转化生长因子约2倍的释放，并提升血管内皮生长因子约3.5倍的释放。
权利要求
1.一种用以活化血小板的添加剂，其特征在于，其包含: 钙离子； 抗氧化剂； 抗生素；及 缓冲液。
2.如权利要求1所述的添加剂，其包含: 0.05 0.5mEq/ml的I丐离子； 100 400mg/ml的抗氧化剂； 20^70 μ g/ml的抗生素；及 缓冲液。
3.如权利要求1所述的添加剂，其中前述缓冲液是医药可接受的缓冲液。
4.如权利要求1所述的添加剂，其中前述缓冲液的pH值范围为5 8。
5.如权利要求1所述的添加剂，其中前述抗氧化剂为谷胱甘肽、维生素C、维生素E、维生素A、类胡萝卜素、辅酶、硫辛酸、类黄酮或其组合。
6.如权利要求1所述的添加剂，其中前述抗生素为硫酸正泰霉素、链霉素、林可霉素、青霉素、四环霉素、氯霉素、红霉素、磺胺类药或其组合。
7.一种促使血小板活化的方法,其包含使样本与如申如权利要求1所述的添加剂混`口 ο
8.如权利要求7所述的方法，其中前述混合的时间为5 20分钟。
9.如权利要求7所述的方法，其中前述样本为血浆。
10.如权利要求9所述的方法，其中前述血浆为富含有血小板的血浆(PRP)。
全文摘要
本发明关于一种用以活化血小板的添加剂。本发明的添加剂包含钙离子、抗生素、抗氧化剂及缓冲液。将所需成份依特定比例混匀后以即取得前述血浆样本的添加剂。本发明的添加剂使用上简便且快速，而所制得的添加剂具有活化血小板的功用，有助于血小板在医疗上的应用。
文档编号A61P19/02GK103110947SQ201110362788
公开日2013年5月22日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者黄美月 申请人:玛旺干细胞医学生物科技股份有限公司