葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析 柱用pH值为6.7的0.03M憐酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.7后上样，上样压力不超过 1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用抑值为6.7的憐酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残 余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3% (m/v)盐酸调节溶液pH至3.5,将调整好的蛋白液 通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
[0108] 化)超滤浓缩:启动超滤器，开始初浓缩，溫度控制在2°C，蛋白浓度达到7% (g/mL) 时，加入2°C注射用水，使蛋白浓度达到3%并进行恒体积超滤透析脱盐，超滤透析过程中蛋 白液体积保持恒定。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8% W上，用2.(TC~ 10.0°C注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
[0109] (F)配制：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3%的HC1调整浓 缩后蛋白液的pH值为3.8,使最终制品中免疫球蛋白含量为50g/L，麦芽糖含量为10% (g/ mU (lOOmL溶液lOg麦芽糖），抗体效价不低于1:800，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低P聞障 育法使制品保持在2rC~25°C下21天进行病毒灭活。
[0110] (G)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释 药液的最终蛋白浓度为53g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌 分装即得成品静注抗手足口病人免疫球蛋白。
[0111] 上述方法制备的抗手足口病人免疫球蛋白其手足口病毒中和抗体效价大于等于 1:800，纯度为98.5 %~100 %，单体和二聚体之和达到99 %~99.5 %，PKA ^OIU/mL，ACA < 45%。
[0112] 实施例3
[0113] 1.供血浆者的血浆筛选采集：
[0114] 选择血浆，采用中和试验法检测原料血浆中的抗手足口病抗体的中和效价应满足 W下条件：中和效价不低于1:80;蛋白质含量(双缩脈法检测）大于等于55g/l;丙氨酸氨基 转移酶(赖氏法监测)不高于35单位;ELISA法测定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/HIV-2抗 体、HCV抗体均为阴性。低溫-20°C W下冰冻储存，保存期不超过2年。
[0115] 2.中和实验法测定原料血浆中抗体效价：
[0116] (A)将血浆样品供试品用细胞维持液(体积百分比3%胎牛血清的DMEM细胞培养 液)预先进行1:4预稀释后，56°C灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释。
[0117] (B)取足够量的96孔细胞培养板，在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒 性型号和代次，在样品板每孔中加入25化细胞维持液，然后加入相应的预稀释灭活的各样 品液25化/孔，每样品平行巧L。
[0118] (C)取手足口病毒EV71用足量的细胞维持液稀释至试验所需浓度（即100 X CCID50/0.05mL)，5化L/孔等量加入细胞培养板中，并同时设置阴性对照孔和病毒回滴孔。
[0119] 细胞(阴性)对照孔:直接加入细胞维持液10化L/孔；
[0120] 病毒回滴孔:先在板孔中加入细胞维持液50化/孔，然后将应用病毒液进行10倍比 稀释后，将攻击病毒液1〇*^与其1〇^、1〇^、1〇^稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96 孔细胞板孔中，5化L/孔。
[0121] (D)中和反应:将各板孔中液体小心混匀后置于37°C，5%(v/v)的C〇2培养箱中进 行中和反应2小时。
[0122] (E)细胞：
[0123] 细胞悬液的配制:取足够量的RD细胞(ATCC购买），培养液为含10%(V/V)胎牛血清 的DMEM，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为IX 105个/mL，配好的细 胞液立即使用。
[0124] 细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液10化L，约1 X 104个/孔；
[0125] (F)培养:将完成W上操作的96孔细胞板放置37°C、含有C〇2体积百分数为5%的培 养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并 记录统计。
[0126] (G)样品中和抗体效价的判定:各样品若两孔均未发生病变则其中和效价<1:80; 若一孔发生病变另一孔未发生病变则中和效价= 1:80;若两孔均发生病变则其中和效价> 1:80。血浆样品W中和效价大于或等于1:80判为合格的高效价抗手足口病特免血浆。
[0127] 3.抗手足口病人免疫球蛋白的制备：
[0128] (A)将1670名具有抗手足口病抗体的供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为 1000L，用中和试验法检测混血浆的中和效价为1:200;
[0129 ] (B)从血浆中分离组分II+111沉淀:将冷冻血浆（即步骤A中的混血浆）100化在溫 度在rC融化，离屯、去冷沉淀，用抑值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.3,加入浓度为 54 % (v/v)的乙醇溶液17IKg，使血浆中乙醇的最终浓度为8 %，使反应液的最终溫度为-4 °C，离屯、分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到6.05,加入浓度为 95 % (v/v)的乙醇溶液16服g，使血浆中乙醇的浓度从8 %达到20 %，使反应液的最终溫度控 制在-5.5°C，加入1.5 % (g/mU的娃藻±做助滤剂15.5Kg，用压滤机进行加压过滤，过滤后 的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分11+ III 沉淀83.75Kg。
[0130] (C)分离组分II沉淀:将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入4倍量预冷的注 射用水500Kg溶解，使反应溫度控制在2°C。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为 5.05，加入45Kg浓度为95 % (v/v)的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18%，反应液溫度 最终控制在-4.5°C，按5. OKg/吨血浆加入娃藻±揽拌30分钟，用压滤机进行加压过滤分离 组分III上清液。向组分III上清液中加入1M碳酸氨钢溶液调节抑值为7.55，每升溶液加入 2.8g氯化钢W提高反应液离子强度。加入95% (v/v)的乙醇溶液，使反应液乙醇的最终浓度 为25%，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终溫度为-10.0°C，继续揽拌0.5小时，静止 1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将 压滤机吹干，打开压滤机，收取25.2Kg组分II沉淀，组分II沉淀即为手足口病人免疫球蛋白 的粗制品。
[0131] (D)层析法纯化:将上步加压过滤后的组分II用3.0°C注射用水溶解7小时，溶解溫 度控制在2.0°C。将充分溶解的组分II用90sp的滤忍过滤澄清，加入3% (m/v)盐酸调节溶液 的抑值至6.5,用5% (m/v)氯化钢溶液调节溶液的电导为1.5ms/m。采用阴离子交换层析介 质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层 析柱用抑值为6.51的0.03M憐酸盐缓冲液平衡至出液的抑值为6.51后上样，上样压力不超 过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.51的憐酸盐缓冲液冲洗凝胶上的 残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3% (m/v)盐酸调节溶液抑至4.01，将调整好的蛋白 液通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
[0132] 化)超滤浓缩：启动超滤器，开始初浓缩，溫度控制在10°C，蛋白浓度达到7% (g/ mU时，加入10°C注射用水，使蛋白浓度达到3%并进行恒体积超滤透析脱盐，超滤透析过程 中蛋白液体积保持恒定。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8% W上，用2.0°C ~10.0°C注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
[0133] (F)配制：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3%的HCl调整浓 缩后蛋白液的pH值为4.4,使最终制品中免疫球蛋白含量为54g/L，麦芽糖含量为10% (g/ mU (lOOmL溶液lOg麦芽糖），抗体效价不低于1:800，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低P聞障 育法使制品保持在2rC~25°C下21天进行病毒灭活。
[0134] (G)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释 药液的最终蛋白浓度为53g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌 分装即得成品静注抗手足口病人免疫球蛋白。
[0135] 上述方法制备的抗手足口病人免疫球蛋白其手足口病毒中和抗体效价大于等于 1:800，纯度为98.5 %~100 %，单体和二聚体之和达到99 %~99.5 %，PKA ^OIU/mL，ACA < 45%。
[0136] 质量检验
[0137] 按上述工艺制备