Bpi-免疫球蛋白融合蛋白质的制作方法

专利名称：Bpi-免疫球蛋白融合蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明是1992年5月19日申请的共同待批美国专利申请No.07/885，911的后续申请。
本发明总的来说涉及用于治疗人体细菌感染的重组杂交融合蛋白质，编码这种蛋白质的DNA顺序，制备该蛋白质的重组方法，和含有该重组产物的药物制剂。本发明的杂交融合蛋白质是编码杀菌/通透性增强蛋白质或其生物活性片段的DNA和编码一个或多个免疫球蛋白重链恒定区之DNA的直接转录融合的表达产物，该融合体已经被掺入到合适的质粒载体中并转染或转化到宿主细胞中。重组产生的BPI-免疫球蛋白融合蛋白质表达产物(以下称为“rBPI-Ig”)可用作内毒素结合蛋白和杀菌剂。
杀菌/通透性增强蛋白质(以下称为“BPI”)是一种与细菌脂多糖(以后称“LPS”)的脂A部分结合的阳离子蛋白质。BPI蛋白质与细菌LPS的结合可以增强敏感性革兰氏阴性细菌的包膜通透性[Ooi，et al.，J.Biol.Chem.，26214891(1987)]。BPI也与可溶性LPS结合。通过酸提取并结合离子交换层析或大肠杆菌(E.coli)亲和层析已从多形核中性白细胞(以下称为“PMNS”)中分离出人BPI蛋白质(Elsbach，et al.，J.Biol.Chem.，25411000(1979);Weiss，et al.，Blood，69652(1987))。
从人PMNs中分离的完整BPI蛋白质对革兰氏阴性细菌具有广谱的强杀菌活性(Elsbach，et al.，J.Biol.Chem.，25411000(1979))。这种抗菌活性似乎与分离的人全BPI蛋白质的氨基末端区有关。相反，分离的人BPI蛋白质的C-末端区只表现出少许可检测出的抗菌活性(Ooi，et al.，J.Exp.Med.，174649(1991))。已经克隆出编码BPL的人DNA，并推断出所编码蛋白质的氨基酸顺序(Gray et al.，J.Biol.Chem.，2649505-9509(1989);美国专利No.5，198，541)。
免疫球蛋白包括一个具有许多相似结构但重要结构不同的蛋白家族，这些不同的重要结构导致不同的抗原结合特性和其他生物学活性。例如，IgG同型抗体具有最长的血清半衰期并且易于穿过胎盘。最强的抗病毒活性与IgA同型抗体有关;而IgM同型抗体具有最大的抗菌效率(Stites，et al.，Basic and Clinical Immunology，P.32(Appleton & Lange，6th ed.1987))。在免疫球蛋白家族中的每个抗体同型中还存在着几种亚类和异型变异体(文献同上)。
所谓“免疫球蛋白基因总家族”的成员一般都具有细胞外区，该区域的特征在于因二硫桥键形成而成多个环。这种成环出现在免疫球蛋白分子的重链恒定区中(命名为CH1，CH2，CH3和CH4)。也存在具有与免疫球蛋白总家族成员中的多成环区同源的多成环区的非免疫球蛋白化合物，这些化合物中的某些已被称为“粘着物”(如参见PCT申请No.Wo 89102922，公布于1989年4月6号;Capon et al.，Nature，337525-531(1989))。
对于本发明特别有意义的报告是重组合成包括以粘着物部分为融合的第一成份和以免疫球蛋白重链恒定区作为融合的第二成份的杂交融合蛋白质。例如Harris，Eur.J，Biol.Chem.194611-620(1990)和Capon et al.，(文献同上)中叙述了CD4/IgG融合的形成。这种分子的结构设计基本原理是基于下述发现，即融合的粘着成份具有与免疫球蛋白成份相似的结构，并且可望能以与免疫球蛋白成份的结构互补的方式折叠。如Gascoigne，et al.，P.N.A.S.(USA)，842936-2940(1987)中叙述了重组嵌合T细胞受体-免疫球蛋白蛋白质。还参见Mariuzza，et al.，J.Biol.Chem.，264(13)7310-7316(1989);Goverman，et al.，Cell 60929-939(1990);Grcgoine，et al.，P.N.A.S.(USA)，888077-8081(1991);Bismuth，et al.，Molecular lmmunol.，27(11)1127-1136(1990)(叙述了类似的T细胞受体-免疫球蛋白融合)。还报道了一种可溶性CD44-免疫球蛋白融合蛋白质(Aruffo，et al.，Cell 611303-1313(1990))。
Ashkenazi等人(P.N.A.S.(USA)，881035(1991))，报道了使用作为肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂的嵌合免疫-粘着蛋白质(一种粘着物的变体)防止内毒素性休克。该文报道的TNF拮抗剂是一种杂交融合蛋白质，其中TNF受体(TNFR)蛋白质的细胞外部分融合到人IgG重链的恒定区上。据报道这种TNFR-IgG融合体可以结合并阻断TNF对放线菌素D处理之细胞的细胞毒作用，并且在内毒素之前使用它可以提供抗内毒素攻击的保护作用。
上述的所有融合蛋白显然都包括了在细胞表面以整合膜蛋白形式表达的分子，并且除CD44和TNF受体之外，它们还具有免疫球蛋白基因总家族的结构特征。
已公开的PCT申请WO 92/03535报道了BPI的氨基末端部分与编码IgG恒定区的cDNA相融合的结构。尽管如此，该报道还没有说明怎样制备这种蛋白-cDNA结构，而且也没有教导怎样构建许多其他类型的BPI-Ig融合体。
本发明提供了用于治疗细菌感染及其后遗症的新的杂交融合蛋白质。还提供了编码这种蛋白质的DNA顺序，制备该蛋白质的重组方法，和含有该重组产物的药物制剂。
根据本发明的一个方面，所提供的杂交融合蛋白质在其氨基末端含有杀菌/通透性增强蛋白质或其生物活性片段，它融合到形成融合蛋白质之羧基末端的免疫球蛋白重链或其异型变体的至少一个恒定区上。
在本发明的一个优选方案中，该融合蛋白质的免疫球蛋白重链恒定区部分含有重链恒定区的两个区，且最优选的是CH2和CH3区。本发明的融合蛋白质在免疫球蛋白和BPI区之间还具有一个免疫球蛋白绞链区。
用于形成本发明杂交蛋白质的免疫球蛋白重链恒定区可以属于任何同型，但最好是以IgG、IgGA或IgM同型或这些同型的异变体为基础的。
在本发明的此优选方案中，杂交融合蛋白质的氨基末端片段包括成熟人BPI蛋白质的176至199个起始氨基末端残基。而且，融合蛋白质的BPI部分可以包含一个BPI类似物，其中在天然BPI序列132和135位之一或两者的半胱氨酸被另一个氨基酸取代，较好是被丙氨酸和丝氨酸取代。如果以重组方法制备时，则以单体或同型二聚体的形式分离融合蛋白质。
根据本发明的另一个方面，提供了编码上述杂交融合蛋白质的DNA序列。还提供了包括这种DNA序列的自动复制DNA质粒载体，以及用该DNA序列以允许其表达的方式稳定转化或转染的宿主细胞。优选能最大程度表达蛋白质产物的DNA掺入到rBPI-Ig融合载体中。本发明的转化的宿主细胞适用于大量生产融合蛋白质的方法中，该方法包括在一种合适的培养基中培养宿主使之生长，并从细胞或其生长培养基中分离蛋白质。
本发明还提供了含有本发明的杂交融合蛋白质和药学上可接受的稀释剂、佐剂及载体物的新的药物组合物。该组合物本身可用于治疗革兰氏阴性细菌感染及其并发症，包括内毒素性休克以及与之相关的一种或多种疾病如弥散性血管内凝血、贫血、血小板减少症，白细胞减少、成人呼吸窘迫症、肾衰竭、高血压、发烧及代谢性酸中毒。将BPI蛋白质或蛋白质片段或类似蛋白质作为融合的一部分与免疫球蛋白(Ig)重链恒定区融合，其提供了Fc受体结合、与LPS的双价结合、补体结合及增加胎盘穿透能力等潜在优点。
在制备药品级BPI产物过程中所遇到的问题是形成可降低产物均一性及活性的宏观颗粒。因此，优选的含rBPI-Ig融合蛋白质的药物组合物包含组合的Poloxamer(聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物)表面活性剂和(聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯)表面活性剂。有关这种结合的教导可参见未决待审的Mc Gregor的美国专利申请No.08/012，360，这种结合在稳定药物活性多肽抗颗粒形成方面具有协同作用。最优选的组合物中rBPI-Ig融合体以1mg/ml的浓度存在于枸橼酸缓冲盐溶液中(0.02M枸橼酸盐，0.15M NaCl，PH5.0)，并含有0.1%重量比Poloxamer 188(Pluronic F-68，BASF Wyandotte，Parsippany，NJ)和0.002%重量单位的聚山梨醇酯80(吐温80，IcI americas Inc.，Wilmington，DE)。
在考虑到下文对本发明优选实施方案所作详细描述的情况下，本领域中的熟练技术人员可以显而易见地认识到本发明的许多其他方面内容和优越性。


图1显示了对含有本发明融合蛋白质的柱洗脱物所作SDS-PAGE分析的结果。
图2和3显示可溶性的、重组产生的BPI(“rBPI”)和rBPI-Ig与LPS的结合。
图4显示固相化的rBPI-Ig与可溶性LPS的结合。
图5显示本发明产物对E.coli J5细胞的杀菌活性。
图6和7显示用羊抗人γ过氧化物酶测定的本发明产物与U937细胞的结合。
图8显示本发明产物与U937细胞表面的不同结合情况。
图9显示rBPI(1-199)-Ig融合蛋白质和rBPI(1-199)与3H肝素的结合。
图10显示125I rBPI(1-199)-Ig融合蛋白质和125I rBPI(1-199)在大鼠体内的血清清除情况。
图11显示涉及rBPI(1-199)和rBPI(1-199)-Ig融合蛋白质的LAL抑制检测的结果。
下面详细描述本发明BPI-Ig融合蛋白质生产。更具体地说，实施例1涉及构建表达本发明各种rBPI-Ig融合蛋白质的DNA序列。实施例2涉及将实施例1的DNA导入到宿主细胞中并表达所编码的蛋白质。实施例3涉及产生、扩大生产、并分离本发明的融合蛋白质。实施例4提供了本发明融合蛋白质的免疫学和活性特征。实施例5提供了本发明融合蛋白质的特性，包括结合特性、药物动力学特性和体内性质。
实施例1构建rBPI-Ig表达载体A.构建用于表达包括IgG区的rBPI-Ig融合蛋白的载体构建用于表达杂交融合蛋白的几个载体，这些融合蛋白一般包括编码BPI部分的DNA与人免疫球蛋白γ-1重链恒定区(IgG1HC;Fc区)的一个或多个区域的直接转录融合体。这些载体中BPI和IgG编码序列间连接点的确切位置各不相同。
基于起初制备的用于表达免疫球蛋白重链基因的载体(例如，pING 2227)构建本文所述的用于在哺乳动物细胞中表达rBPI-Ig融合蛋白质的质粒载体。有关构建pING 2227的描述可参见Robinson et al.，Ham.Antibod.Hybridoma)284-93，(1991)。该载体包含下述特征性结构小鼠免疫球蛋白重链增强子成份，来源于小鼠Abelson病毒DNA的LTR增强子-启动子，所要表达之基因5′末端的Sv40 16S切接点，以及在3′末端的人基因组γ-1多聚腺苷酸化序列。该载体具有可以插入所要表达之基因的SalI和SstII克隆位点。该载体还含有一个在SV40早期启动子控制下的可选择标志(neo)，以及用于在大肠杆菌中生长所必需的pBR322序列。衍生于pING2227的载体pING2237N含有一个在独特AatII位点处被导入到衍生于pBR322的pING2227序列中的唯一NotI位点。pING2237N并不含有所说的neo可选择标志基因，而是含有一个如Simonsen等人(P.N.A.S.(USA)，802495-2499(1983))所述的改变了的小鼠二氢叶酸还原酶(“DHFR”)基因序列。用于下述某些rBPI-Ig构建的质粒pMB27基本上相同于pING2237N，其中结合了一个对嵌合H65的重链编码区具有特异性的DNA插头，后者是一个抗由小鼠可变区和人IgG1恒定区组成的CD5的抗体。
用表达载体pING4503作为编码重组表达产物的DNA的一个来源，所说的重组表达产物被命名为“rBPI(1-199)”，即一个具有如SEQ ID Nos1和2中所列出的成熟人BPI之N末端31残基信号序列和前199个氨基酸的多肽，不同的只是在151位的缬氨酸以GTG表示而不是GTC，且185位残基是谷氨酸(由GAG表示)而不是赖氨酸(由AAG表示)。本文定名的BPI产物“rBPI(1-199)”以往称为“rBPI-23”，并且全rBPI蛋白质以前被称为“rBPI-50”(如参见Gazzano-Santoro，et al.，Infection and Immunity，604754-4761(1992)、共同申请人的未决待审美国专利申请No.07/885，911)。将pING4503中的BPI编码DNA插入到该载体中的独特SalI和SstII位点中。质粒pING4503除了以一个gpt可选择性标志代替DHFR以外，基本上是与pING 2237N相同的。
设计两个载体，质粒pING4511和质粒pING4512，用于使编码LBPI的30bp 5′非翻译区、信号序列和前191个氨基酸的DNA在读码内以平头接点与IgG HC DNA序列相融合。
1.构建pING4511为了构建pING4511，用AlwNI切割质粒pING4503，并用T4 DNA聚合酶将其末端填成平头，然后再用SalI切割此DNA。所得到的约700 bp SalI/平头DNA片段包含有30 bp 5′未翻译序列和编码BPI之信号及前191个氨基酸的DNA，并用凝胶纯化该片段。使用下列引物从质粒pMB27(如上所述)中PCR扩增IgG HC序列(1)设计具有序列5′-CGTATGGCCAGCACCTGAACTCCT-3′(SEQ.I.D.NO.3)的引物CH2-Msc，以用于进行上链扩增，并在扩增的CH2区之5′端导入一个MscI位点(IGGCCA)。
(2)设计具有序列5′-GAGGGCTTTGTTGGAGA-3′(SEQ.I.D.NO.4)的引物KAQ-γ3，以用于从pMB27中IgG HC的SstII位点序列下游(3′)开始下链扩增。
使用GeneAmp PCR Kit药盒(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)按照厂商提供的程序完成PCR扩增。典型的PCR扩增反应运行30个循环，包括在94℃下变性1分钟，在55℃下退火2分钟，在72℃下延伸3分钟，最后在72℃下延伸10分钟。用MscI和SstII消化用上述引物扩增的DNA，并凝胶纯化所产生的约1856p片段。该片段的5′(平头)端被设计为相当于紧接在铰链区之后的位于IgG HC之CH2区5′端的序列“PAPELL……”(SEQ ID NO5);3′端则与CH2区内的独特SstII位点相对应。将此片段与SalI/平头BPI DNA片段(如上述)一起连接到来源于pMB27的SalI/SstII消化的载体片段中，以产生质粒pING4511。测定pING 4511中平头BPI-IgG连接处的序列后，发现MscI位点没有被消化，并因而可知融合蛋白质的IgG部分与BPI部分不在同一的翻译阅读框架中。因此不用该质粒转染哺乳动物细胞，但用它作为下述其他载体构建中的片段来源。
2.构建pING4512使用与构建pING4511所用方法相似的方法构建pING4512，包括将编码30 bp 5′未翻译区的DNA序列、信号序列和BPI的前191个氨基酸与IgG HC序列融合，后者还包括IgG HC的铰链区。使用引物KAOγ3和具有序列5′-CAGTTTAAAACTCACACATGCCCACC-3′(SEQ.I.D.NO.6)的引物CH2-ZC-Dra对来源于pMB27的IgG部分进行PCR扩增，并设计为在扩增片段的5′端导入一个DraI位点(TTTAAA)。用DraI和SstII消化扩增的PCR片段，并凝胶纯化所产生的约210 bp的片段。将此片段的5′(平头)末端设计为与序列“KTHTCPPC……”(SEQ.I.D.NO.7)(也即IgG重链铰链区的上游4个残基)相对应;3′端则与CH2区中的独特SstII位点相对应。然后将此片段与来源于pING 4503的约700 bp SalI/平头BPI片段(如上述)一起连接到来源于pMB27的SalI/SstII切割的载体上以产生pING 4512。根据对pING 4512中平头BPI-IgG连接点的序列测定，发现DraI位点没有被消化。该IgG部分与BPI部分位于同一的阅读框架中，并且在BPI和IgG HC间的连接处插入了编码氨基酸Gln-Phe的序列5′-CAGTTT-3′。质粒pING 4512已寄存于美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA，保藏日期1992年5月12日，登记号ATCC 75239。
3.构建pING 4514和pING 4515构建两个rBPI-IgG融合载体，即质粒pING 4514和pING 4515，它们都含有融合到IgG序列上的30 bp 5′未翻译序列、信号序列和人BPI的起始199个氨基末端氨基酸。使用位于成熟BPI序列前199个氨基酸内的引物BPI-55′-AGCTTCCCAGTTCCCAG-3′(SEQ.I.D.NO.8)和与BPI片段序列的3′端相对应的(也即穿过残基199的)BPI-115′-TATTTTGGTCATTACTGGCAGAGT-3′(SEQ.I.D.NO.9)在pING 4503内对BPI片段DNA插入物的3′端进行PCR扩增来完成对上述两个载体的构建。用Bst BI(载体中唯一的BPI编码区中的一个位点)切割所产生的PCR片段，然后纯化该代表通过氨基酸199的BPI氨基末端片段之3′端的100bp DNA片段。为了构建pING 4514(它代表了BPI片段DNA与不带免疫球蛋白铰链区之IgG HC的融合)，将下列3个片段连接在一起100bp BstBI/平头BPI 3′末端片段、来源于pING 4511的MscI-SstII IgG HC片段和来源于pING 4511的BstBI-SstII载体。质粒pING 4511已寄存于美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA，保藏日期1992年5月12日，登记号ATCC 75240。为了构建pING 4515(代表BPI片段DNA与包括铰链区之IgG HC序列的融合)，将下列3个片段连接在一起100bp BstBI/平头rBPI(1-199)3′端片段;来源于pING 4512的DraI/SstII IgG HC片段和来源于载体pING 4511的BstBI-SstII片段。质粒pING 4515已寄存于美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA，保藏日期1992年5月12日，登记号ATCC 75241。
4.构建pING 4528构建一个BPI-IgG融合载体，其中BPI信号序列置于rBPI的残基61-191(也即缺失成熟BPI的1-60位残基)的编码区之前，并且与编码IgG HC之铰链-CH2-CH3区的DNA融合。为了获得编码BPI信号序列的片段，用EagI消化一种含有与pING 4503中相同的BPI DNA插入物的质粒PIC110，该质粒分别在5′和3′端带有SalI和SstII位点，并已克隆到pT7T3 18U(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的SmaI位点中。用T4 DNA聚合酶将该末端修成平头，再用SalI消化该DNA。对产生的大约123 bp SalI/平头片段(代表30 bp的5′未翻译DNA和BPI信号序列)进行凝胶纯化。用质粒pING 4512(如上述)获得一个含有融合到IgG HC序列上的BPI残基61-191之编码区的片段。用EcoRI消化pING 4512以在编码残基60-61(Glu-Phe，GAATTC)的区域切割该BPI序列。这样产生一个46p的5′突出端AATT。为了使该片段的5′端变成平头，并且使之在读码内以残基61位(Phe，TTC)开始，只在脱氨三磷酸腺苷存在的情况下用T4 DNA聚合酶填充下链的3′缩入端，而留下一个2碱基对5′突出端AA。用绿豆核酸酶处理以去掉5′突出端，产生所需平头。用DraⅢ(位于3′聚腺苷酸化区中的唯一位点)从载体中切下包括某些3′旁侧载体序列的所需rBPI-Ig编码DNA片段。对所产生的平端/DraⅢ 1963 bp片段进行凝胶纯化。然后连接下列3个片段以构建pING 4528约123 bp SalI/平端BPI信号序列片段，含平端/DraⅢ rBPI-Ig的片段，和来源于pING 4506(基本上相似于上述rBPI表达载体pING 4503，但含有一个gpt标志)的SalI/DraⅢ载体片段。
5.构建其他载体上述的载体pING 4511，pING 4512，pING 4514和pING 4515均含有小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因作为选择标志。可构建含有rBPI-IgG融合和其他可选择标志的相似载体。例如，pING 4529含有一个与pING 4512所含插入物相同的DNA插入物，但该载体含有gpt选择标志而不是DHFR。
使用本文所述的方法可以构建其他的可在哺乳动物细胞中表达的载体(代表编码BPI序列之DNA与编码IgG重链序列之DNA的融合)。例如，融合的BPI部分可以包括BPI序列的任何部分缺失，而不是上述的特定缺失。另外，BPI序列的部分又可以是被取代、改变或突变的，或者是利用它们的组合。IgG部分可由重链恒定区序列的任何部分组成。
B.构建载体以用于表达包括IgM区的rBPI-Ig融合蛋白质使用含有在pBR 322中克隆的人IgM重链基因组DNA的质粒pJB 123作为IgM HC恒定区DNA序列的来源。从EMBL数据库中获得人IgM HC恒定区的DNA序列，登录号X14940。从pJB 123(得自P.Leder)中切下一个1672 bp PstI片段，并将其亚克隆到质粒pTTT3 18U(Pharmacia)的PstI位点中，以产生质粒pICI09。切下的PstI片段包括IgM HC的部分DNA序列，该序列从正好在CH2区之前的内含子的3′端开始，并延伸到位于IgM序列的CH4区和第一膜外显子之间内含子中。切下的PstI序列还进一步编码外显子，以编码IgM HC的CH2，CH3和CH4区，包括干扰序列。按下述方法获得用于构建rBPI-IgM融合载体的部分Ig M DNA序列。用PstI切割质粒pICI09。用T4 DNA聚合酶将末端修成平头，然后用BanI切下插入物的3′端。用凝胶纯化所产生的1456 bp片段。该片段的5′平头包括一个额外的GTG，用于编码缬氨酸，它位于CH2外显子的编码区之前。因BanI在该片段的3′端消化，而将DNA在位于CH4外显子末端的终止密码子上游切掉11个碱基对。为了再构建CH4的3′端并置入一个SstII位点以有利于克隆到哺乳动物表达载体中，合成两个互补的寡核苷酸具有序列5′-GCACCTGCTACTGACCGC-3′(SEQ.I.D.NO.10)的“IgM-BS接头”和具有序列5′-GGTCAGTAGCAG-3′(SEQ.I.D.NO.11)的“IgM-SB接头”。使这两个寡核苷酸退火，产生一个带BanI和SstII粘性末端的小接头片段。为了得到最后的表达载体，将平端/BanI IgM片段(含CH2，CH3和CH4区)和BanI/SstII接头片段与100bp Bst BI/平头BPI 3′末端片段(如上文3，A部分中所述)一起连接到来源于pING 4506的Bst BI-SstII载体片段上;其中pING 4506是一个结合有特异性限定信号肽的DNA插入物和rBPI(1-199)残基并且包括gpt选择基因的表达载体。所得到的载体被命名为pING 4517。质粒pING 4517已寄存于美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA，保藏日期1992年5月12日，登记号ATCC 75242。
C.构建用于表达rBPIala132-Ig融合蛋白质的载体构建含有BPI N末端片段的表达载体，其中第132位残基的半胱氨酸被丙氨酸取代。重组产生的这种类型的类似物一般命名为“rBPIala132”，而含有这种类似物并已融合到免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白质一般定名为“rBPIala132-Ig”。构建用于表达rBPIala132-IgG融合蛋白质的三个载体，其中融合蛋白质的rBPIala132部分包含BPI N末端的前191或176个氨基酸(分别命名为“rBPI(1-191)ala132-Ig”和“rBPI(1-176)ala132”。
1.构建pING 4531为了获得含有已融合到IgG重链恒定区上之“rBPI”(1-191)ala132的pING 4531，首先构建质粒pING 4519。有关pING 4519的构建在共同申请人的未决待审美国专利申请No.08/013，801(Theofan)中已作了详细描述。简言之，就是使用只在编码rBPI(1-191)的DNA中出现过一次并位于132和135位半胱氨酸残基之间的PvuII位点(CAGCTG)构建pING4519。用SalI和SstII消化pING 4530，以获得编码BPI(1-199)片段并包括一个31氨基酸信号序列的DNA，其中pING 4503是一个含有位于特有SalI和SstII位点之间的BPI(1-199)片段、小鼠免疫球蛋白重链增强子成份、来源于Abelso小鼠白血病病毒(A-MuLv)DNA的LTR增强子-启动子成份，位于待表达基因5′端的SV40 19 S/16S切接接头，和位于待表达基因3′端的人基因组γ-1聚腺苷酸化位点的载体。
纯化含有BPI(1-199)的SalI-SstII片段并用PvuII消化，产生一个大约529 bp的SalI-PvuII片段和一个大约209 bp的PvuII-SstII片段，然后分别纯化这两个片段。
质粒pING 4519含有一个BPI编码插入物，其中132位编码半胱氨酸的密码子被该位点编码丙氨酸的密码子所取代。为了造成这一取代，使用引物BPI-6，AAGCTTGTCGACCAGGCCTTGAGGT(SEQ ID NO.12)和BPI-14，CTGGAGGCGGTGATGGTG(SEQ ID NO.13)对上述BPI编码序列进行PCR扩增，其中所说的引物已掺入了编码132位丙氨酸所必需的碱基取代。使用Gene Amp PCR药盒(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)，按照厂方推荐的程序完成PCR扩增。用SalI消化所产生的PCR片段得到一个526 bp SalI平端片段，将该片段与上述的大约209 bp的PvuII-SstII片段和用SalI-SstII消化pING 4503所得到的大载体片段相连接，以产生pING 4519。
用AlwNI消化pING 4519，用T4聚合酶处理，并用SalI消化产生一个含有rBPI(1-199)ala132之残基(1-191)的约700 bp片段，从而构建成有意义质粒pING 4531。然后，用DraI和DraⅢ消化pING 4512，产生一个大约1565 bp片段，它含有融合蛋白质的免疫球蛋白部分和额外的下游载体序列。最后，用DraⅢ和SalI消化pING 4513，并纯化含有gpt标志的大载体片段。连接上述的3个载体片段产生pING 4531。
2.构建pING 4534和pING 4535质粒pING 4534含有BPI-Ig融合体，该融合体包含一个截短形式的rBPI，其中包括BPI N末端的起始176个氨基酸，并且其中存在有132位丙氨酸对半胱氨酸的取代(命名为“rBPI”(1-176)ala132)。另外，pING 4534只含有IgG重链的CH2和CH3区。为了获得截短的rBPI(1-176)ala132类似物，用BstBI消化编码rBPI(1-199)的DNA，以在167位氨基酸之后切断之。使用两个已退火的互补寡核苷酸，BPI-24，5′-CGAAACAAGATGAACAGCCAGGTCTGCGAG-3′(SEQ ID NO14)和BPI-25，5′-CTCGCAGACCTGGCTGTTCATCTTGTTT-3′(SEQ ID NO15)取代额外的BPI序列(即168-176位氨基酸)。
连接下列片段以构建含有编码rBPI(1-176)ala132-Ig融合蛋白质之DNA的载体pING 4534来源于含有全部载体序列和编码rBPI(1-176)ala132DNA之pINF 4531的SstII-BstI片段，来源于pING 4511的大约186 bp MscI-SstII片段和经退火BPI-24和BPI-25所产生的BstBI平头片段。
质粒pING 4535除还含有一个免疫球蛋白铰链区外与pING 4534相同。使用下列3个片段构建质粒pING 4535含有SstII-Bst BI载体和来源于pING 4531之BPI的片段，来源于pING 4512的约210 bp的DraI-SstII免疫球蛋白编码片段，和通过退火BPI-24和BPI-25所产生的BstBI平头片段。
D.构建用于表达rBPI-Ig融合蛋白质的最佳载体1.构建具有最佳表达所需之成份的含rBPI的载体构建含有适于最佳表达rBPI-Ig融合蛋白质所需之DNA序列的质粒。为了完成此过程，使用以前公开于共同申请人(Theofan等人)的未决待审美国专利申请No.08/013，801中的几个质粒作为最佳表达融合蛋白质所需成份的来源。这种所需成份包括但不限于最佳化Kozak翻译起始序列和小鼠轻链转录终止序列。
质粒pING 4533含有rBPI(1-199)ala132，它带有一个起始ATG，与相符Kozak翻译起始序列GCCACCRCCATGG(SEQ ID NO16)[Kozak，Nucl.Acids Res.，158125(1982)]相连。使用已在BPI信号的-27位ATG(蛋氨酸)之前掺入SalI限制性位点和核苷酸GCCACC的PCR引物BPI-23ACTGTCGACGCCACCATGGCCAGGGGC(SEQ ID NO17)和与rBPI(1-199)编码序列之3′端相对应的引物BPI-2CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT(SEQ ID NO18)，从含有全长度BPI cDNA[在pGEM-7zf(+)中)的质粒进行BPI序列的PCR扩增而制得该载体。
用SalI和EcoRI消化约700 bp PCR扩增的DNA，并纯化所得的包含大约前3个BPI(1-199)编码序列的270 bp片段。将SalI-EcoRI片段连接到两个其他片段上(1)来源于pING 4519的420 bp EcoRI-SstII片段，它编码BPI(1-199)的剩余部分，其中在132位丙氨酸取代半胱氨酸;和(2)来源于pING 4502的约800 bp SstII-SalI载体片段(一个基本上相似于pING 4503的载体，不同的是它不包含有30 bp 5′未翻译序列并且具有一个gpt标志而不是DHFR标志)，以产生含有gpt标志的pING 4533。
还构建另一个载体系列，这些载体含有在构建用于最佳化表达基因产物的含BPI-Ig融合体之载体过程中所用的成份。这些载体以pING 4537为基础，后者是一个与pING 4533基本相似的载体，但它含有人轻链聚腺苷酸化序列和小鼠轻链转录终止序列而不是pING 4533中的人重链序列。从pING 3170中获得小鼠κ3′序列，该载体编码人轻链cDNA并包含小鼠基因组轻链3′转录终止序列。完成这一过程需要用SstI消化，切下小鼠轻链终止密码子的35 bp下游，用T4 DNA聚合酶处理以造成平头，然后用BamHI切割，并纯化包括小鼠κappa 3′序列的约1350碱基对片段。所得到的片段包括大约250 bp的人轻链恒定区cDNA的3′部分和聚腺苷酸化信号，后接如Lui等人在J.lmmunol.1393521(1987)中所述称为△8构件的BamHI接头。该约1350碱基对片段的剩余部分包括一个BglII-BamHI小鼠κ3′基因组片段，即Xu等人在J.Biol.Chem.，2613838(1986)中所述的“D”片段，并且由它提供转录终止序列。此片段可用于与下述来源于pING 4533的两个片段进行的三段连接-3044碱基对片段，它包括所有的BPI插入物和经用SstII消化、T4聚合酶处理及NotI消化获得之载体的一部分，以及一个约4574 bp的Bam HI-NotI片段。所产生的载体pING 4537除了上述的在基因组3′未翻译区中的差异外，基本相同于pING 4533。
使用pING 4537作为κ3′片段的来源构建含κ3′未翻译序列的其他载体。用XhoI(它在紧跟BPI终止密码子之后的特有XhoI位点切割)和BamHI消化pING 4537并分离这样的片段。将产生的约1360 bp XhoI-BamHI片段用于一系列的3片段连接以产生两个载体，这两个载体在信号序列的-27位残基处都含最佳化Kozak翻译起始序列。其中的第一个载体pING 4543含有gpt标志，并可通过将来源于pING 4223的4574 bp BamHI-NotI片段与大约3019 bp的含NotI-XhoI BPI插入物的片段及pING 4537 XhoI-BamHI片段相连接而得到。第二个载体pING 4146含有DHFR标志，并可通过将pING 4222约4159碱基对的BamHI-NtoI片段与约3019碱基对的含pING 4223 NotI-XhoI BPI插入物的片段及pING 4537的XhoI-BamHI片段相连接而得到。
2.构建用于表达rBPI-Ig融合蛋白质的载体构建含有编码rBPI-Ig融合蛋白质之DNA的表达载体，它包含上部分所述质粒最佳化表达融合蛋白质所需的成份。
这些载体中的第一个载体pING 4156包含如pING 4512中的相同BPI编码区，并可使用来自下列三个其他构造的载体片段构建而成1)来源于pING 4143的270 bp SalI-EcoRI片段，它包含KozaK序列和BPI编码区的大约前三分之一;
2)通过用XhoI消化，用T4聚合酶修成平头和用SalI切割而从pING 4143获得的载体序列;以及3)来源于pING 4512的大约1092 bp EcoRI-NaeI片段，其含有经过氨基酸191的BPI序列之剩余部分和免疫球蛋白序列。
第二个载体，pING 4157，含有一个已融合到免疫球蛋白铰链-CH2-CH3区上的编码rBPI(1-176)的DNA插入物，其可通过三片段连接组装而成。第一片段是一个来源于pING 4145(一个除在132位含有野生型半胱氨酸外基本上与上述的pING 4143相同的载体)的590 bp SalI-BstBI片段。将此片段连接到用XhoI消化pING 4145并用T4聚合酶将末端修成平头，再用SalI切割而获得的载体序列上。第三个连接片段是来源于pING 4535的约720 bp BstBI-NaeI片段。由于pING 4156和pING 4157都含有gpt标志，故可根据已知技术构建含其他标志，如his或DHFR的构件，如包括前部分所述的那些。这样的两个载体是pING 4158和pING 4159，它们除了都含有DHFR标志而取代gpt外，分别与pING 4156和pING 4157相同。
现将含有rBPI-Ig融合蛋白质的所有前述载体构建总结于下列表1中。

实施例2A.转染CHO细胞以生产rBPI-Ig融合蛋白质哺乳动物细胞是生产本发明蛋白质的优选宿主细胞，因为这种细胞可以分泌杂二聚体和多聚体蛋白质并使之合适地折叠，还可以提供翻译后修饰如原序列(pro-sequence)加工和糖基化。
可以用作生产本发明rBPI-IgG融合体之宿主的哺乳动物细胞包括淋巴源细胞，如杂交瘤Sp2/0-Ag14(ATCC CRL 1581)和成纤维细胞源细胞，如Vero细胞(ATCC CRL 81)，CHO-K1，CHO-DXB11，或CHO-DG44。后一个细胞系(从Dr.Lawrence Chasin，Columbia University处获得的CHO Toronto的一种DHFR突变体)保存于加有10%胎牛血清并补充有谷氨酰胺/青霉素/链霉素的Ham's F12培养基中(Irvine Scientific，Irvine，CA)。
运用Wigler等人(Cell，11223(1977))的磷酸钙方法用线性化的pING 4512，pING 4514或pING 4515 DNA(40μg，用PvuI消化，酚-氯仿提取和乙醇沉淀)转染CHO-DG 44细胞。磷酸钙处理之后，将细胞置于T75烧瓶中，使其在含有无核苷之αMEM培养基(Irvine Scientific)和补充有透析的胎牛血清(用4L冷的0.15 NaCl在4℃下以6000-800截留分子量将100ML血清透析16小时)的选择性培养基中生长获得转染体。未转染的CHO-DG 44细胞不能在这种培养基中生长，因为它们具有DHFR突变，并在连续补充选择性培养基过程中被除去。在1.5至2周时，只观察到由转染细胞组成的小菌落。对于pING 4512和pING 4514来说，通过胰酶消化和在96孔平板中限制性稀释进行亚克隆而从烧瓶中除去转染的细胞。对于pING 4515来说，使转染的细胞在补充有0.1μM氨甲蝶呤的选择性培养基中以混合培养物的形式生长。然后通过胰酶消化和在96孔平板中限制性稀释进行亚克隆而从烧瓶中除去氨甲蝶呤抗性细胞。
用抗γELISA法分析亚克隆是否在培养上清中含有IgG反应性蛋白质。在该项分析中，用羊α-人γ抗血清预包被Immulon-II96孔平板(Dynatech)。然后加入上清液样品，并用过氧化物酶标记的羊抗人γ抗血清检测结合的α人γ反应性蛋白质。对于pING 4512和pING 4515转染体来说，在选择性αMEM培养基中扩展15个有最好生产能力的阳性克隆。然后使pING 4512转染体在补充有0.1μM氨甲蝶呤的选择性培养基上生长。对于pING 4514来说，使最佳生产能力的15个阳性克隆在补充有0.1μM氨甲蝶呤的选择性αMEM培养基中扩展。用α-γELISA法在不活动的48孔培养物中再次估测亚克隆的生产能力。对于pING 4512和pING 4515转染体来说，根据γELISA测定结果，最佳分离物分别分泌大约5和10μg/ml。由γELISA测得pING 4514转染体的单个最佳亚克隆分泌了大约10μg/ml。用γELISA法测知最佳pING 4512亚克隆的上清液在抗BPI ELISA分析中也表现阳性。从pING4512和pING 4515转染体的每个中选择三个分离物，并从pING 4514转染体中选择四个分离物以用于进一步研究。每一组中有最佳生产能力的亚克隆产生的rBPI-IgG融合蛋白质均按比例增加。最佳生产克隆是pING 4512(克隆100M，菌株C1551)，pING 4514(克隆8D7，菌株C1552)和pING 4515(克隆4E6，菌株C1549)。这三个细胞系已寄存于美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852 USA，保藏时期1992年5月12日，登记号分别是ATCC CRL 11043，ATCC CRL11044，和ATCC CRL 11042。
实施例35.在滚轴瓶中成比例地增殖并产生BPI-IgG融合蛋白质利用在滚轴瓶中生长来产生含rBPI-IgG融合蛋白质的细胞。使用质粒pING 4512进行下面的生长，分离和测定步骤，并且是作为一举例给出的。可以将类似的方法用于本发明的其他质粒，这对于本领域中的普通熟练技术人员来说是显而易见的。对于每个滚轴瓶，均用转染的细胞接种T150烧瓶(含59ml无核苷的αMEM和10%透析的胎牛血清)，并使细胞生长会合(约3-4天)。然后用胰酶消化该细胞，并转移到含500ml Ham's F12培养基和10%胎牛血清的900cm2滚轴瓶中，使之生长会合(约3天)。一旦细胞会合，去除Ham's F12培养基，并更换500ml HB-CHO无血清培养基(Irvine Scientific，Irvine CA)。以前曾发现，向滚轴瓶中的HB-CHO培养基中加入无菌S-Sepharose小珠(Pharmacia，fast-flow ＃17-0511-01)可以达到从滚轴瓶中最佳纯化重组BPI片段的目的(参见共同申请人Grinna的未决待审美国专利申请No.07/885，501;也可参见共同申请人最近提交的美国专利请No._(代理案卷号No.27129/31405)，其公开内容作为参考被本发明引用)。首先清洗小珠并高压灭菌(121℃灭菌20分钟，10ml一份)，然后无菌操作加入到各滚轴瓶内的HB-CHO培养基中。将细胞在37℃下保温3天，此时去除培养基/小珠。按下述方法从无菌小珠上纯化rBPI-IgG融合产物。还可以用回收的细胞在含Sepharose小珠的新鲜HB-CHO培养基中进行第二次和第三次生产循环(2天/循环)，以便增加每个滚轴瓶中的rBPI-IgG产量。可以用T烧瓶替代滚轴瓶来完成类似步骤。
B.分离rBPI-Ig融合体从滚瓶中取出生长培养基和S-Sepharose树脂，收集在一起并放置至少15分钟使S-Sepharose沉降在容器底部。倾出大量培养基和澄清的树脂，并通过过滤装置如多孔过滤盘进行过滤，以除去细胞，并保留S-Sepharose。倾去培养基后，将S-Sepharose悬浮于醋酸盐缓冲液中(该缓冲液含20mM醋酸钠/醋酸，PH4.0，并含0.1M NaCl)轻轻搅拌，使之沉降10分钟。然后倾去缓冲液，将小量S-Sepharose转移到合适大小的液相层析柱上。用Econocolumn柱(BioRad，Richmond，CA)(2.5×10cm)分析从3-5个滚瓶中收集的20-40克S-Sepharose树脂样品。用0.1M NaCl-醋酸盐缓冲液洗填充的S-Sepharose柱直到洗脱物的A280吸收值等于0.1M NaCL-醋酸盐缓冲液的吸收值。用0.7M NaCL-乙酸盐缓冲液、1.0M NaCL-乙酸盐缓冲液和1.5M NaCL-乙酸盐缓冲液连续洗柱。收集各部分。主要在1.5M NaCL-乙酸盐缓冲液部分中洗脱出rBPI-IgG融合蛋白质。
实施例4A.产生抗rBPI(1-199)的多克隆抗血清为了举例说明，将由pING 4512 DNA转染的细胞表达的BPI-Ig融合蛋白质用于本实施例的方法。用纯化的rBPI(1-199)片段作为抗原在兔(Cocalico Biologicals，Reamstown，PA)体内产生多克隆抗血清。发现兔抗血清与激发抗原和重组BPI全蛋白质(“rBPI-50”)以及rBPI-IgG融合蛋白质(pING 4512的表达产物)具有交叉反应活性，不过对激发抗原的免疫反应活性要比对全蛋白质rBPI或融合蛋白质的免疫反应活性大。该抗体可有效地用于ELISA，Western印迹分析和免疫沉淀，并且在大多数情况下以大于1∶2000的稀释度使用。
B.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析步骤在还原条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分离从S-Sepharose柱(如实施例2所述)的1.5M NaCL-乙酸盐缓冲液洗脱物中得到的含有由pING 4512分泌之融合蛋白质的蛋白样品。首先调整样品至含有小于0.5ml NaCl，然后加入冰冷的丙酮达到最终75%的丙酮浓度使之沉淀。然后以大于10，000rpm的转速离心5到10分钟使得到的蛋白沉淀物沉淀成团块。除去上清，将沉淀物悬浮于凝胶样品缓冲液中，该缓冲液含有8M尿素、2%SDS、60mM Tris HCl，PH6.8，加有或不加50mM二硫苏糖醇。将悬浮样品和合适的蛋白质分子量标准品(BioRad，Richmond，CA and BRL，Bethesda，MD)分别加热至95℃ 3-5分钟，然后装到均一百分比或线性百分比的聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上，并使用小Protean II型凝胶电泳设备(BioRad)进行分离。电泳之后，对凝胶直接进行考马斯(Coomassie)染色(0.5%考马斯亮兰-R，25%异丙醇，10%乙酸，染色1小时，用10%甲醇，10%乙醇脱色)，或者将其用于电转移。将SDS-PAGE分离的蛋白质在硝化纤维素(BA85，Schleicher and Schuell，keene，NH)或PVDF(lmmobilon-P，Millipore，Bedford，MA)膜上与合适的预染色的标准蛋白质(BioRad)一起进行电迁移。在10% CAPS(环己氨基-1-丙磺酸)，10%甲醇，PH11.5中以0.5安培转移20分钟。将产生的印迹用于氨基酸测序，或者用蛋白-A-金处理以检测IgG重链，或用1∶2000稀释度的兔抗rBPI抗体处理再用1-1000稀释度的过氧化物酶结合的羊抗兔抗体处理以检测rBPI。为了进行rBPI Western印迹分析，使用Western Lite Chemiluminescent Detection System(Tropix System，Bed ford，MA)根据厂家的说明展现印迹。使用0.25%的明胶代替Tropix I-Blook，并且在电转移时不使膜干燥。将处理过的膜暴露于Cronex 4胶片(Dupont，Wilmington，DE)。
图1显示从pING 4512产生的BPI-Ig融合蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。左泳道是考马斯兰染色的凝胶。将中间和右泳道的谱带电转稀到PVDF膜上，并按Western印迹分析处理方式进行处理。中间泳道是用蛋白-A-金产生的印迹用于检测人IgG。右侧泳道是用兔抗BPI抗体处理接着用过氧化物酶结合的羊抗兔抗体处理并用Western Lite Chemiluminescent Detection Kit药盒检测而产生的印迹(如实施例4所述)。
C.分子量测定按B部分所述，用SDS-PAGE和继后的考马斯染色对用1.5M NaCL-乙酸盐缓冲液从S-Sepharose上洗脱的样品进行分析，发现作为主要成份，是具有表观分子量95，000至110，000道尔顿并与rBPI-IgG融合蛋白质的高二聚体大小相对应的蛋白质。在还原条件下，该100kd蛋白质具有表观分子量45，000至50，000道尔顿，与所说融合蛋白的单体大小相符。
D.氨基末端氨基酸序列将实施例2所述的S-Sepharose柱的1.5M NaCL-乙酸盐缓冲液洗脱物加在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到PVDF膜上进行考马斯染色，观察到100kd蛋白谱带，然后从膜上切下该谱带，用气相序列测定仪(Applied Biosystems，Model 470A)对其进行氨基末端氨基酸序列测定。测定该100kd蛋白质的氨基末端氨基酸序列是Val-Asn-Pro-Gly-Val-Val(SEQ.I.D.No.19)。这个序列与由体内分泌途径在信号序列的氨基酸-1和+1之间裂解信号序列所产生的氨基末端序列相一致。
E.融合蛋白质之杂交特性的证据将相同的1.5M NaCL-乙酸盐缓冲液洗脱物样品在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电转移到PVDF膜上用于Western印迹分析。用蛋白-A-金进行Western分析直接检测融合蛋白质的IgG重链部分。结果表明100kd谱带含有IgG蛋白序列。对使用兔抗-BPI(1-199)抗体处理过的同一电转移的样品进行Western分析以检测rBPI-IgG融合蛋白质的BPI部分。此Western分析表明在95kd至110kd区中存在BPI免疫反应活性蛋白质，而在小于95KD和大于110KD的区内只有很小量的BPI特异性免疫反应活性。对由质粒pING 4512产生的rBPI-IgG融合蛋白质进行的Western印迹分析示于图1中，其中左泳道是考马斯染色的，中间泳道是用蛋白-A-金产生的，而右侧泳道是用兔抗体产生的。
F.活性检测与BPI氨基末端区相对应的片段呈现有BPI的临床相关活性。这些活性包括革兰氏阴性细胞中的通透增强活性和杀菌活性(Elsbach，et al.J.Biol.Chem.，26214891(1987))，以及它结合可溶性脂多糖(LPS)和中和中性白细胞之激活作用的能力。rBPI-IgG融合蛋白质具有这些活性表明该融合蛋白质的BPI部分是处于正确的折叠状态。融合蛋白质的CH2-CH3(Fc)部分应表现出Fc受体和补体结合活性。这些活性的存在表明融合蛋白质的Fc区也是处于正确的折叠状态。进行几种试验以检测由CHO细胞纯化的各种融合蛋白质的BPI和Fc相关活性。
1.脂多糖-Western分析法使用上述用于蛋白质SDS-PAGE的15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶以凝胶电泳法将大肠杆菌(菌株0111-B4)或明尼苏达沙门氏菌(Rd突变体)脂多糖(LPS，Sigma，st.Louis，MO)样品分成每份20μg至60μg的剂量范围。电泳之后，按照上述转移蛋白质的方法用CAPS缓冲液将LPS样品与预染色的蛋白质标准样品(BioRad)一起从聚丙烯酰胺凝胶上电转移到硝化纤维素(BA 85，SChleicher和Schuell)上。将该膜于37℃在30mg/ml BAS、50mM Tris、0.2M NaCl、PH7.4(TBS)中浸渍30分钟，然后将此膜于21°-24℃下在含有2-4μg部分纯化的rBPI-IgG融合蛋白质或对照重组蛋白质[rBPI(1-199)或全rBPI]的TBS溶液中保温12-18小时以处理这些LPS印迹。然后用TBS洗涤该膜，在30分钟内更换至少3次溶液。然后将该膜在1∶1000稀释度的兔抗rBPI(1-199)抗体在TBS、1mg/ml BSA中制成的溶液中保温3小时。洗涤至少3次后，使用上述B部分所述的Western Lite ChemiLuminescent Detection System处理该膜。对LPS凝胶的一式两个泳道进行银染色，在图2和3中分别给出了Rd.明尼苏达沙门氏菌(S.minnesota)和(0111-B4)结合的结果。每个凝胶最左侧的泳道是银染色的LPS。如图所示，从质粒pING 4512产生的rBPI-IgG融合蛋白质与固定在硝化纤维素上的LPS的结合相同或更好于对照重组蛋白质，rBPI(1-199)及全rBPI。
2.脂多糖俘获试验将终体积50μl有不同稀释度的rBPI-IgG样品和重组BPI蛋白质[rBPI(1-199)或全rBPI]结合到含PBS的96孔1mmulon-2型干底多孔平板(Dynetech Labs)上。结合之后，用0.05%吐温-20和PBS洗平板，并在37℃下与含大肠杆菌0111-B4或明尼苏达沙门氏菌Rd脂多糖(20pg)的0.05%吐温-20、BPS一起保温2小时。然后用0.05%吐温-20、BPS强烈地洗该平板，用Limulus Amebocyte Lysate药盒(Whitlaker，Walkersville，MD)显影，在EL309微平板自动阅读器(Bioteck Instruments，Winooski，VT)上于405nm处读数。结果图示于图4中，该结果显示固相化的rBPI-IgG与可溶性LPS的结合相同或更好于对照重组蛋白质，rBPI(1-199)或全rBPI。
具体地讲，图4显示了不含LPS的样品(柱A)、不含BPI的样品(柱B)，只含LPS的样品(柱C)，含pING 4512产生的rBPI-IgG融合蛋白质的样品(柱D)，含rBPI(1-199)的样品(柱E)或含全rBPI(柱F)样品的LPS俘获试验结果。
3.大肠杆菌生长检测法可以几种方法测定BPI的杀菌活性。在所有这些方法中，加入大约100mM氯化镁可以减小或消除BPI的杀菌效果。一种测试方法是对本发明的rBPI-IgG融合蛋白质进行培养液生长抑制试验。
该检测法是以用BPI片段或rBPI-IgG融合蛋白质处理大肠杆菌后的培养液生长抑制为基础的。检测中所用的细胞是J5细胞(一种带有短链LPS的大肠杆菌“粗糙”菌株)，该细胞已在三乙醇胺缓冲的矿物盐培养基(Simon，et al.，Pro.Nat′l.Acad.Sci.(USA)，51877(1964))中生长以使得该细胞对BPI的作用尤其敏感。洗涤该细胞，并再悬浮于0.9% NaCl中达到大约5×108/ml的浓度。然后将大约5×106至1×107个细胞与5μg/ml pING 4512和pING 4514 rBPI-IgG融合蛋白质或重组蛋白质rBPI(1-199)在总量为200-400μl的缓冲液(10% Hanks平衡盐水、40mM Tris-HCl，pH7.5，0.1%酪蛋白氨基酸)中保温30分钟。还在100mM MgCl2存在下将融合蛋白质再与大肠杆菌一起保温。单独与rBPI-IgG融合蛋白质或rBPI(1-199)片段一起保温后，用补充有0.9% NaCl的10体积营养培养液稀释细胞，使之生长几小时。如图5所示，结果表明融合蛋白质基本上保留了与rBPI(1-199)蛋白质相关的杀菌活性，其中A线代表用pING 4512产生的融合蛋白质和镁处理;B行代表用pING 4514和镁处理，C线代表对照组[只有缓冲液];D线代表用pING 4514产生的融合蛋白质处理;E线代表用pING 4512产生的融合蛋白质处理;F线代表用BPI(1-199)处理。正如所预料的，此活性可被氯化镁抑制。用pING 4515 rBPI-IgG融合蛋白质可以获得类似结果。
4.Fc受体结合测试验使用人单核细胞系U937检查rBPI-Ig融合蛋白质与Fc受体的结合，其中细胞系已知可表达高亲和性FcR1(CD64)受体(kd＝10-8-10-9)和低亲和性Fc RII(CD32)受体(kd＝10-7或更高)。
为了进行此试验，将存在于DMEM+1% BSA中的U937细胞在4℃下与浓度为100nM至0.8nM的两种rBPI-Ig融合蛋白质(来源于pING 4512和pING 4514)中的任一种或浓度为67至0.5mM的嵌合小鼠-人抗体阳性对照蛋白质一起于V形底96孔平板中保温3小时。然后用DMEM+1% BSA将细胞洗3次(200μl/洗涤;4℃下以1000 RPM离心平板)。向平板孔内加入羊α-γ过氧化物酶(1/4000稀释)或α-κ过氧化物酶(1/1000稀释)，并将细胞在室温下保温1小时。按上述方法洗3次后，向各孔内加入100μl显色剂(溶于12.5ml枸橼酸盐缓冲液+5μl H2O2中的5mg邻苯二胺二盐酸化物[O-PD]并在室温下将平板保温15-20分钟。加入100μl/孔1.8M H2SO4以终止显色，并测定A490处的吸光率。
用α-γ和α-κ抗体测定的结果分别示于图6和7中，结果表明rBPI-Ig融合蛋白质和嵌合H65 IgG对照蛋白质都结合到U937细胞上。在图6和图7中，线C代表嵌合H65 IgG对照蛋白质;线B代表由pING 4514产生的BPI-Ig融合蛋白质;线A代表pING 4512产生的BPI-Ig融合蛋白质。这些蛋白质与U937细胞的相对亲和性估算如下pING 4512产物＝～7nM;pING 4514产物＝～4nM;嵌合H65 IgG＝～0.2nM。这些结果提示高亲和性受体(FcRI)可被rBPI-Ig融合蛋白质和嵌合H65 IgG两者结合。但是，不能排除rBPI-IgG融合蛋白质与其他受体(可能是低亲合性FcRII)的结合，因为在饱和状态下这些融合蛋白质的吸收值(A490＝2.0)明显地大于嵌合IgG在饱和状态下的吸收值(A490＝0.4)。这些结果还说明融合蛋白质可比嵌合IgG结合更多的受体或者说明对融合蛋白质用α-γ抗体检测结合的融合蛋白质比检测结合的嵌合IgG更有效。还用U937检测了几个其他的IgG′s(与pING 4512融合蛋白质白比较)，并且这些IgG的行为类似于嵌合H65 IgG。用U937和pING 4512融合蛋白质表达产物，嵌合H65及rBPI(1-199)进行如上述的类似实验，但是用兔α-人BPI抗血清检测结合在细胞表面上的rBPI-Ig。如图8所示，(其中A线代表pING 4512产生的BPI-Ig融合蛋白质;B线代表rBPI(1-199);和C线代表嵌合H65 IgG对照蛋白质)结果表明只有rBPI-Ig融合蛋白质可在U937细胞表面上被检测出。
实施例5rBPI-Ig融合蛋白质的特性检测本发明rBPI-Ig融合蛋白质结合肝素的能力、该融合蛋白质的药物动力学特性、体内活性和LAL抑制作用。
A.比较rBPI-Ig和rBPI(1-199)的肝素结合能力使用直接3H-肝素结合实验分析rBPI(1-199)和rBPI-Ig融合蛋白质与肝素的竟争性结合。该实验是基于衍生尼龙膜能以高容量结合蛋白质。事先将这种膜掺入到Millipoe Corp.公司(Bedford MA)(Multiscreen IP Plates)产生的96孔微量滴定板的底部，并且可以从每个孔中取出以进行闪烁计数。
为了进行这一试验，将用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PH7.4)稀释的rBPI(1-199)或rBPI(1-191)-IgG融合蛋白质以100pmol/孔的浓度加入到带尼龙膜的96孔平板的孔中。当吸收到膜上后，用含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭缓冲液封闭各孔。用此封闭缓冲液以5-4μg/ml制备3H肝素(DuPont，NEN，Wilmington，DE)的系列稀释液，并于4℃下在rBPI(1-199)或rBPI(1-191)-IgG包被的孔中保温1小时。1小时后，吸出未结合的肝素，并用封闭缓冲液洗涤各孔三次，干燥后取出用液体闪烁计数器测定结合的3H-肝素的量。
实验结果示于图9中，其中空方块代表rBPI(1-199)与肝素的结合;菱形代表rBPI(1-191)-Ig融合蛋白质与肝素的结合;和实心方块代表本底。图9所示的结果表明，当rBPI(1-199)在所希望的BPI Kd值范围内(表观亲和性＝114±30nM)与肝素结合时，融合蛋白质不能表现出类似的结合特性。甚至在最高3H肝素测定浓度(2.5μM)下融合蛋白质也不能达到饱和。因此，rBPI(1-191)-IgG融合蛋白质与肝素的结合大约比本底高3倍，但rBPI(1-199)则不是这样。
B.rBPI-Ig融合蛋白质的药物动力学特性给雄性CD小鼠静脉内注射1mg/kg125I-BPI(1-191)-IgG融合蛋白质或缓冲液以测定rBPI-Ig融合蛋白质的体内药物动力学特性。从融合蛋白质或缓冲液给药后0.5分钟至24小时收集血样，测定125I放射活性。还用TCA沉淀法和SDS-PAGE法分析血清样品，以确定与rBPI-Ig和较高分子量蛋白质相关的血清放射活性量。
在下面的表2和图10(其中三角代表rBPI-Ig融合蛋白质，圆圈代表rBPI(1-199))中，提供了前述研究所获得的药物动力学参数。表格提供了从图10曲线中获得的定量数据。正如表2和图10所示，融合蛋白质的血清浓度表现出两阶段清除并持续达给药后的2小时，分别为2.5±0.2分钟的α+1/2和39±13分钟的β-+1/2。表2还示出了平均滞留时间(MRT)(融合蛋白质在体内残存时间的一种计算方法)、清除率、中心体积分布(Vc)和静态体积分布(Vss)。该表中还给出了代表图10中曲线下面积的数据，其提供了另一种测定体内残留时间的方法。在表2或图10中所测得的rBPI(1-199)和rBPI(1-191)-IgG融合蛋白质之间的任何药物动力学特性均没有统计学上的显著性差异。
C、rBPI-Ig融合蛋白质的体内效应在体内致死性内毒素血症动物模型中进行研究以评价rBPI-IgG融合蛋白质的效应。在此项研究中，对雄性ICR小鼠静脉内给药，注射放线菌素D(800μg/kg)和0.1μg/kg或0.3μg/kg内毒素(大肠杆菌0111∶B4)的混合物。注射放线菌素D和内毒素之后，马上给小鼠第二次静脉内注射rBPI-IgG融合蛋白质或含有20mM枸橼酸钠，150mM氯化钠和0.1% Poloxamer以及0.002%聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，pH5.0的BPI配制品缓冲液(表3中的“缓冲液对照”组)。其中一组第二次注射PBS(磷酸盐缓冲盐水)(表3中的“阴性对照”组)。然后计算7天内每天死亡数。此项研究的结果示于下列表3中。
此项研究的结果表明5μg/kg的rBPI-IgG融合蛋白质可以显著地防止以0.3μg/kg内毒素攻击的放线菌素D致敏的小鼠体内内毒素的致死性效应。
D、LAL抑制试验对rBPI(1-199)和rBPI(1-191)-Ig融合蛋白质进行鲎溶解物LAL抑制试验，以确定这些化合物的LPS结合特性。具体地讲，将rBPI(1-199)或rBPI(1-191)-Ig融合蛋白质在Eppendorf试管中与固定浓度的大肠杆菌0113 LPS(4ng/ml终浓度)混合，并在37℃不时振动下保温3小时。保温之后，向各试管内加入360μl D-PBS以达到200pg/ml的LPS浓度用于LAL试验。然后以每孔50μL的体积将各样品转移到ImmulonII条(Dynatech，Chantilly，VA)中。
以每孔50μl加入鲎溶解物(Quantitative Chromogenic LAL药盒，Whitaker Bioproducts，Inc.，Walkersville，MD)，并在室温下保温25分钟。保温后再以100μl/孔的体积加入生色底物，并充分混合。室温下保温20-30分钟后，加入100μl的25%醋酸以终止反应。然后在多平板阅读仪(Vmax，Medical Devices Menlo Park，CA)上测定405nm处的光密度。
LAL试验结果示于图11中，其中实线代表用rBPI(1-191)-Ig融合蛋白质获得的结果，带实圈点线代表用rBPI(1-199)蛋白质获得的结果，而带空方块的点线代表无LPS对照。如图中所示，在对鲎变形细胞溶解物试验中对LPS刺激的抑制能力方面rBPI(1-199)和rBPI(1-191)-Ig融合蛋白质之间的试验结果没有显著性差异。
本领域中的熟练技术人员在考虑到前述的本发明优选实施方案后，实施本发明时可作出许多修改和变化。因此，对本发明的范围内的限制只在后面的待批权利要求中体现出来。
序列表(1)一般资料:
(Ⅰ)申请人:Theofan,GeorgiaGrinna,LynnsHorwite,Arnold(Ⅱ)发明名称:BPI-免疫球蛋白融合蛋白质(Ⅲ)序列数:19(Ⅳ)联系地址:
(A)地址:Marshall,O′Toole,Gerstin,Murray Sc Borun(B)街道:6300 Sears Tower,233 South Wacker(C)城市:Illinois inois(D)国家:USA(F)编号:60606-6402(Ⅴ)计算机阅读形式:
(A)媒介类型:软盘(B)计算机:IBM PC兼容(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS(D)软件:patentIn Release #1.0,Version #1.25
(Ⅵ)目前申请数据(A)申请号:
(B)申请日:
(C)分类:
(Ⅷ)代理机构/代理人 资料(A)名称:Meyers Thomas C.
(B)登记号:36,989(C)案卷号:30659(Ⅸ)通讯信息:
(A)电话:312/474-6300(B)传真:312/474-0448(C)电报:25-3856(2)SEQ ID NO:1的资料(Ⅰ)序列特征:
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Val Asn Pro Gly Val Val
权利要求
1.一种杂交融合蛋白质，在其氨基末端包括有杀菌/通透性增强蛋白质或其生物学活性片段，并且在其羧基末端含有免疫球蛋白重链的至少一个恒定区或其等位基因变体。
2.根据权利要求1的杂交融合蛋白质，它包含有两个免疫球蛋白重链恒定区。
3.根据权利要求2的杂交融合蛋白质，其中所说的两个免疫球蛋白重链恒定区是CH2和CH3区。
4.根据权利要求1的杂交融合蛋白质，在融合体的杀菌/通透性增强蛋白质和免疫球蛋白部分之间还包含免疫球蛋白铰链区。
5.根据权利要求1的杂交融合蛋白质，其主要由有杀菌/通透性增强蛋白质的起始191个氨基酸氨基末端残基组成。
6.根据权利要求1的杂交融合蛋白质，其主要由杀菌/通透性增强蛋白质的起始199个氨基酸氨基末端残基组成。
7.根据权利要求1的杂交融合蛋白质，其主要由杀菌/通透性增强蛋白质的起始176个氨基酸氨基末端残基组成。
8.根据权利要求1的杂交融合蛋白质，其中在所说杀菌/通透性增强蛋白质中第132位的半胱氨酸残基被另一个氨基酸取代。
9.根据权利要求8的杂交融合蛋白质，其中所说的在杀菌/通透性增强蛋白质第132位的半胱氨酸残基被丙氨酸取代。
10.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的杂交融合蛋白质，其含有人蛋白质序列。
11.根据权利要求1的杂交融合蛋白质，其为单二聚体形式的。
12.根据权利要求1的杂交融合蛋白质，其中所说的免疫球蛋白重链的恒定区选自由IgG，IgA和IgM免疫球蛋白组成的一组中。
13.一种编码杂交融合蛋白质的DNA序列，在杂交融合蛋白质的氨基末端带有一个杀菌/通透性增强蛋白质或其生物学活性片段，并在其羧末基端含有免疫球蛋白重链的至少一个恒定区或其等位基因变体。
14.根据权利要求13的DNA序列，其包含编码两个免疫球蛋白重链恒定区的DNA序列。
15.根据权利要求14的DNA序列，其包含编码CH2和CH3重链恒定区的DNA序列。
16.根据权利要求13的DNA，其包含编码从BPI的起始176个氨基末端残基到杀菌/通透性增强蛋白质的起始199个氨基末端残基的编码区。
17.根据权利要求13的DNA，其包括编码杀菌/通透性增强蛋白质起始191个氨基末端残基的编码区。
18.根据权利要求13的DNA，其包含编码杀菌/通透性增强蛋白质的起始199个氨基末端残基的编码区。
19.一种含有权利要求13之DNA之序列的DNA载体。
20.根据权利要求19的DNA载体，其选自下列一组载体pING 4512(ATCC 75239)，pING 4514(ATCC 75240)，pING 4515(ATCC 75241)和pING 4517(ATCC 75242)。
21.一种宿主细胞，该细胞已用权利要求13的DNA序列以允许在所说宿主细胞中表达由该序列编码的融合蛋白质的方式稳定地转化或转染。
22.一种根据权利要求21的原核宿主细胞。
23.一种根据权利要求21的真核宿主细胞。
24.一种根据权利要求21的具有保藏登记号ATCC CRL 11042的宿主细胞。
25.一种根据权利要求21的具有保藏登记号ATCC CRL 11043的宿主细胞。
26.一种根据权利要求21的具有保藏登记号ATCC CRL 11044的宿主细胞。
27.一种生产杂交融合蛋白质的方法，该融合蛋白质在其氨基末端包含杀菌/通透性增强蛋白质或其生物学活性片段，在其羧基端包含免疫球蛋白重链的至少一个恒定区或其等位基因变体，所说的方法包括使权利要求21的宿主细胞在合适的培养基中生长;和从所说宿主细胞或所说培养基中分离所说的杂交融合蛋白质。
28.一种药物组合物，其含有权利要求1的杂交融合蛋白质和药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。
29.一种治疗人体内细菌感染、内毒素血症、脓毒血症等的方法，包括使用有效量的权利要求28的药物组合物。
全文摘要
本发明公开了新的杂交融合蛋白质，在其氨基末端包含有杀菌/通透性增强蛋白质或其生物学活性片段，并在其羧基末端包含至少一种免疫球蛋白重链恒定区，该蛋白质可用于治疗细菌感染。还公开了编码这些蛋白质的DNA序列，产生这些蛋白质的重组方法以及含有该重组产物的药物制剂。
文档编号C12N15/13GK1096821SQ9310904
公开日1994年12月28日 申请日期1993年6月21日 优先权日1992年5月19日
发明者G·蒂奥芬, L·S·格林纳, A·霍维茨 申请人:索马公司