)，P<0. 0001)。本发明的抗人PD-1抗 体或其抗原结合部分的优点还表现在其在真核表达系统中的表达量相对于现有技术的抗 人PD-1抗体或其抗原结合部分的表达量得到显著提升，在一些实施方案中，表达量高至少 50%、至少100%，在一些实施方案中，表达量高至少150%、至少200%、至少300%、至少 400%。在一些实施方案中，真核表达系统为哺乳动物细胞表达系统。在一些实施方案中， 哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢（CHO)细胞、小仓鼠肾度HK)细胞、COS细胞、小鼠 NSO胸腺 瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。在一些实施方案中，哺乳动物细胞为CH0细胞。本领 域的真核表达载体都可W用于本发明的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的表达。在一些 实施方案中，所述真核表达载体为pCMVp-NEO-BAN载体、pEGFP增强型绿色巧光蛋白表达载 体、pEGFT-Actin增强型绿色巧光蛋白/人肌动蛋白表达载体、pSV2表达载体、CMV4表达载 体、pCMV-163等。在一些实施方案中，真核表达载体为pCMV-163。
[0029] 本发明的某些实施方案设及设及抗hPD-1抗体或其抗原结合部分，其重链可变区 CDR1序列如沈Q ID NO: 1所示，CDR2序列如沈Q ID N0:2所示，CDR3序列如沈Q ID N0:3 所示；和/或轻链可变区的CDRl序列如SEQ ID N0:4所示、CDR2序列如SEQ ID N0:5所示， 〔0尺3序列如569 10^:6所示，或者与569 10^:1-6所示序列具有至少70%的同源性且 保留相应母体序列生物活性的变体序列，如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%的序列同源性，或SEQ ID NO :1-6所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸 残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基 酸残基。。
[0030] 在某些实施方案中，本发明的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分包含上述重链 CDR1、CDR2 和 CDR3 和轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3。
[0031] 在某些实施方案中，本发明抗体的重链可变区序列如SEQ ID N0:7所示；和/或 轻链可变区序列如SEQ ID N0:8所示，或者与SEQ ID N0:7-8所示序列具有至少70%的同 源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，如至少80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、 98%、99%的序列同源性，或SEQ ID N0:7-8所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个 氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 个氨基酸残基。。
[0032] 在某些实施方案中，本发明的抗体为全长抗体，例如但不限于IgGl或者IgG4同种 型的全长抗体；或者为抗原结合片段，例如但不限于F油片段、F油'2片段、单链抗体等；
[0033] 本发明的另一方面设及包含治疗有效量的本发明的抗hPD-1抗体或其抗原结合 片段的组合物。所述组合物例如但不限于免疫偶联物、双特异性分子W及药学上可接受的 载体等。本发明的组合物还可W包含另一种活性成分，如另一种用于调节受试者免疫应答 的活性成分。
[0034] 本发明的另一方面设及编码本发明的抗hPD-1抗体或其抗原结合部分的核酸分 子。在某些实施方案中，上述核酸分子的序列如SEQ ID NO :9或10所示，或者与SEQ ID NO: 9或10具有至少70%同源性且仍编码具有本发明的抗体或其抗原结合部分的活性的变体 分子，或者与序列如SEQ ID NO :9或10所示的核酸分子完全互补或在中度至高度严格条件 下杂交的核酸分子。在一些实施方案中，所述严格杂交条件为为了说明的目的，用于测试本 发明的多核巧酸与其他多核巧酸杂交的合适中等严格条件包括在5 X SSC、0. 5% SDS、1. OmM 邸TA(p册.0)的溶液中预洗；在50-60°C、5XSSC、过夜的条件下杂交；再于65°C下20分钟 用含0. 1%SDS的2X、0. 5X和0. 2X的SSC各洗涂两次，合适的高严格杂交条件包括上述 的条件，所不同的是杂交溫度升高了，例如达到60-65°C或65-70°C。
[0035] 本发明的另一方面设及包含此类核酸分子的表达载体。在某些实施方案中，所述 表达载体是原核表达载体或真核表达载体。在某些实施方案中，所述表达载体是真核表达 载体。在某些实施方案中，所述真核表达载体是pCMVp-NEO-BAN载体、pEGFP增强型绿色巧 光蛋白表达载体、祀GFT-Actin增强型绿色巧光蛋白/人肌动蛋白表达载体、pSV2表达载 体、CMV4表达载体、pCMV-163等。在一些实施方案中，真核表达载体为pCMV-163。
[0036] 本发明的还一方面设及包含此类表达载体的宿主细胞。在某些实施方案中，所述 宿主细胞选自细菌、真菌、放线菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述宿主 细胞选自哺乳动物细胞，更具体地，所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢（CH0)细胞、小仓 鼠肾度HK)细胞、COS细胞、小鼠 NS0胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。
[0037] 本发明的一个方面设及生产本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括步 骤：将上述包含本发明的表达载体的宿主细胞在适合所述抗hPD-1抗体或其抗原结合片段 表达的培养条件下表达，任选地，将表达的抗体或其抗原结合片段进行纯化。本领域技术人 员知晓适合抗体或其抗原结合片段表达的培养条件。
[0038] 本发明的另一个方面设及使用所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段调控哺乳动 物包括人的免疫应答的方法，其包括向哺乳动物包括人施用本发明的抗体或其抗原结合片 段，使得所述哺乳动物包括人的免疫应答得到调控，所述调控包括免疫应答的增强、增加或 刺激。
[0039] 本发明的一个方面设及所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段在制备用于调控哺 乳动物包括人的免疫应答的试剂中的用途。
[0040] 本发明的一个方面设及所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其用于调控哺乳 动物包括人的免疫应答。
[0041] 本发明的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段能够特异性识别人和猴的PD-1分子，阻 断PD-1/PD-L1 W及PD-1/PD-L2相互作用，调节免疫应答，提高免疫应答水平。本发明的抗 人PD-1抗体与人PD1特异性结合并表现出良好的特性。运些特性包括与人PD-1的高亲和 力结合，但与CD28、CTLA4、BTLA W及IC0S等其它CD28家族成员没有交叉反应。本发明的 抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的优点尤其表现在其阻断PD1/PDL1的活性相对于现有技 术具有显著性的提高。本发明的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的优点还表现在其在真 核表达系统中的表达量相对于现有技术的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的表达量得到 显著提升。
【附图说明】
[0042] 图1表达载体pCMV-163的物理图谱。
[0043] 图2双夹屯、ELISA检测细胞培养上清中抗体表达水平。
[0044] 图3 SG001抗体和BMS01阳性抗体特异性识别抗原人PD1。
[0045] 图4 SG001抗体和BMS01阳性抗体与CD28家族其他成员无特异性结合。
[0046] 图5 SG001抗体特异性竞争BMS01阳性抗体识别祀抗原。
[0047] 图6 SG001抗体和BMS01阳性抗体特异性阻断PD1/PDL1相互作用。
[0048] 图7 SG001抗体和BMS01阳性抗体特异性阻断PD1/PDL2相互作用。
[0049] 图8A :SG001抗体特异性识别猴PD1和人PD1 ;
[0050] 图8B :BMS01阳性抗体特异性识别猴PD1和人PD1。
[005。 图9 SGOOl抗体和BMSOl阳性抗体体外增强免疫应答反应。
[005引 图10 SG001抗体和BMS01阳性抗体体内增强免疫应答反应。
【具体实施方式】 [005引定义
[0054] 本文所用的术语"抗体"包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特 异抗体和多反应性抗体）W及抗体片段。因此，在本说明书任意语境使用的术语"抗体" 包括但不限于任意的特异性结合成员、免疫球蛋白类型和/或同种型（例如，IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgM、IgA、I曲、I姐和IgM);和其生物相关片段或特异性结合成员，包括但不限 于Fab、F(ab'）2、Fv和scFv(单链或相关物）。本领域知晓，抗体是包含通过二硫键内部相 连的至少两个重（H)链和两个轻（L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。重链由重链可变区 (VH)和重链恒定区（CH1、C肥和C册）组成。轻链是由轻链可变区（VL)和轻链恒定区（化） 组成。重链和轻链两者的可变区都包括框架区（FWR)和互补决定区（CDR)。四个FWR区相 对保守，而CDR区（CDRUCDR2和CDR3)代表超变区并且从N肥末端到C00H末端排列如下： FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结 合结构域，而依据同种型，恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。
[00巧]同时，本文所定义的"抗体"也包括嵌合抗体、人源化抗体和重组抗体、产生于转基 因非人类动物的人抗体W及选自利用本领域技术人员可使用的富集技术产生的库的抗体。
[0056] 术语"可变"是指抗体间可变（V)区的某些片段在序列上存在广泛差异。所述V 结构域介导抗原结合并且定义了特定抗体对于其特定抗原的特异性。然而，可变性并非均 匀分布在跨越110个氨基酸的可变区域中。相反，V区域由每个均长9-12个氨基酸的被称 为"超变区"的具有极度可变性的较短区域所分割的具有15-30个氨基酸的相对不变的被 称为框架区（FR)的片段组成。天然的重链和轻链的可变区每一个都包括四个FR，大多采 取β-片层构型，通过3个超变区相连，其形成连接部分β-片层结构，并且在某些情况中 形成部分β-片层结构的环。每条链中的超变区通过FR紧密相连，并与来自其它链的超变 区一起促进抗体的抗原结合位点形成。
[0057] 本文的术语"超变区"是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区通常包含 来自"互补决定区"（"CDR")的氨基酸残基。
[005引本文所用术语"单克隆抗体"指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即包含个体 抗体的群体除可能少量存在的天然发生的突变之外是相同的。术语"多克隆抗体"是指包 括抗不同决定簇（"表位"）的不同抗体的制备物。
[0059] 本文的单克隆抗体包括"嵌合"抗体，其中部分重链和/或轻链与来自特定物种的 或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列是相同或同源的，而链的其余部分与来自另 一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体W及此类抗体的片段的相应序列是相同的 或同源的，只要它们