人白介素17a和白介素26联合用于制备治疗轮状病毒感染的药物中的应用及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及人白介素17A和白介素26联合用于制备治疗 轮状病毒感染的药物中的应用，还涉及利用人白介素17A和白介素26体外抑制轮状病毒的 方法。
【背景技术】
[0002] 轮状病毒（Rotavirus，RV)属于呼肠弧病毒科，为无胞膜双链RNA(dsRNA)病毒，11 条dsRNA各缠绕1分子的RNA依赖RNA多聚酶（VP1)和1分子的鸟苷酸及甲基转移酶（VP3) 位于病毒颗粒的核心，编码12种蛋白质，包括6种结构蛋白（VP1~4、6~7)与6种非结 构蛋白（NSP1~6)。VP2构成轮状病毒的内层衣壳包裹病毒基因组；VP6构成的中层衣壳 包绕VP2形成轮状病毒双层衣壳颗粒（DLP) ;VP4和VP7构成的外层衣壳再包绕DLP形成完 整的轮状病毒三层衣壳颗粒（TLP)。轮状病毒在受体的介导下穿过细胞膜进入细胞，脱掉外 层衣壳形成DLP开始复制过程，新生成的病毒dsRNA与蛋白在胞浆中聚集形成病毒质粒，并 在其中组装生成DLP，DLP不具有感染能力，其随后进入内质网，与新合成的VP4和VP7装配 成具有感染能力的TLP并分泌出宿主细胞，完成病毒的复制过程。轮状病毒感染能抑制宿 主细胞蛋白的表达，激活宿主细胞内多种蛋白激酶如PKA、PKB、PKC、PKG以及酪氨酸蛋白激 酶的激活，引起肠上皮细胞连接的破坏、肠粘膜通透性增加。轮状病毒感染是导致婴幼儿腹 泻的主要病因，每年引起约1.25亿例儿童胃肠炎，仅我国每年就大约有千万婴幼儿患轮状 病毒感染性胃肠炎。
[0003] 辅助性T细胞17 (Thl7)是CD4+的免疫细胞亚群，与多种感染性疾病和炎症性疾 病密切相关，Thl7细胞可通过分泌人白介素17A(IL-17A)、人白介素17F(IL-17F)及白介素 26 (IL-26)等细胞因子抵抗外来感染和促进炎症的发生，Thl7细胞对轮状病毒感染也有一 定的防御作用。但是在轮状病毒感染的前期，适应性免疫细胞群未能及时发挥功能，Thl7细 胞不能有效启动，致使病毒在肠道上皮细胞内大量增殖，所以即使有预防性疫苗，每年仍有 大量患儿遭受轮状病毒感染之痛，感染后的有效治疗显得尤为重要。
[0004] 因此，急需一种能够快速高效抑制轮状病毒感染的方法，为临床治疗轮状病毒感 染奠定基础。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供白介素17A和白介素26联合用于制备治疗 轮状病毒感染的药物中的应用；本发明的目的之二在于提供白介素17A和白介素26联合用 于制备抑制轮状病毒复制的药物中的应用；本发明的目的之三在于提供利用白介素17A和 白介素26体外抑制治疗轮状病毒复制的方法。
[0006] 为实现上述发明目的，经大量研究，本发明提供如下技术方案：
[0007] 1、白介素17A和白介素26联合用于制备治疗轮状病毒感染的药物中的应用。
[0008] 优选的，所述白介素17A为重组人白介素17A，所述白介素26为重组人白介素26。 更优选的，所述白介素17A的浓度为1. 5-2ng/ml，所述白介素26的浓度为10-20ng/ml。
[0009] 2、白介素17A和白介素26联合用于制备抑制轮状病毒复制的药物中的应用。
[0010] 优选的，所述白介素17A为重组人白介素17A，所述白介素26为重组人白介素26。 更优选的，所述白介素17A的浓度为1. 5-2ng/ml，所述白介素26的浓度为10-20ng/ml。
[0011] 3、利用白介素17A和白介素26体外抑制治疗轮状病毒复制的方法，包括以下步 骤：
[0012] A.将液氮中冻存的Caco-2细胞取出后置入37°C水浴中使其融化，然后将Caco-2 细胞转入DMEM培养基中，混匀，然后在1200rpm/分钟条件下离心10分钟；弃上清，再加入 含10% (v/v)胎牛血清的DMEM高糖培养基，混匀，然后将细胞转入培养瓶中，于37°C、C02体积分数为5%的培养箱中贴壁培养12小时；
[0013] B.倒掉瓶内培养液，用DMEM培养液清洗细胞2-3次，然后吸除残余液体，在培养瓶 中加入猪胰蛋白酶至质量分数为〇. 25%，于37°C培养箱中消化5-10分钟，再加入含体积分 数为5 % FBS的DMEM培养基，轻轻吹打使团块细胞分散均匀，然后于1200rpm/分钟条件下 离心10分钟，再加入DMEM完全培养基；接着按照1 X 105/孔的密度将细胞接种到24孔板 中，于37°C、体积分数为5%的C02培养箱中贴壁培养12小时，再按IX 10 7/孔的浓度将轮 状病毒接种到细胞中，继续培养24小时；
[0014] C.倒掉旧培养基，加入新鲜的含体积分数10% FBS的DMEM高糖培养基，然后加入 1. 5~2ng/ml的白介素17A，于37°C、体积分数为5%的C02培养箱中培养12小时；然后再 在培养基中加入浓度为10~20ng/ml的白介素26继续培养24小时，即可。
[0015] 优选的，所述白介素17A为重组人白介素17A，所述白介素26为重组人白介素26。
[0016] 本发明的有益效果在于：本发明提供了白介素17A和白介素26联合用于制备治疗 轮状病毒感染的药物的新用途，通过合理利用抗轮状病毒的细胞因子（IL-17、IL-26)抑制 其在细胞内复制，即当细胞被轮状病毒感染后，通过先加入重组人IL-17A，抑制轮状病毒复 制，而后加入IL-26,进一步清除轮状病毒。从而达到抑制其增殖并保护肠上皮细胞免受更 深侵害。为细胞的轮状病毒感染治疗提供了新的思路，也为临床治疗轮状病毒感染奠定了 基础。
【附图说明】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0018] 图1为CCK-8鉴定不同实验组Caco-2细胞活性。
[0019] 图2为RT-PCR检测不同实验组Caco-2细胞内轮状病毒的DNA数量。
【具体实施方式】
[0020] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0021] 本发明中重组人IL-17A、IL-26均购自英国abcame公司（货号分别为：abl94179、 abl63231) ;CCK-8购自日本Dojindo公司（货号：CK04)，DMEM高糖培养基购自美国Thermo Fisher 公司（货号：11%5_118);荧光定量检测试剂盒 SYBR GREEN Realtime PCR Master Mix购自日本TOYOBO公司（货号为：FSQ-101)。
[0022] 实施例1
[0023] 利用白介素17A和白介素26体外抑制治疗轮状病毒复制的方法，具体步骤如下：
[0024] A.从液氮罐中取出Caco-2细胞（人结直肠腺癌细胞株）冻存管，立即置入37°C 水浴中，不时摇动，1分钟内使其融化；将冻存管表面擦拭干净，酒精消毒后在超净工作台 上进行后续操作；将冻存管中的细胞转入装有5ml DMEM培养基的10ml离心管中，玻璃滴管 混匀；将装有Caco-2细胞的10ml离心管置于水平离心机中，1200rpm/分钟，离心10分钟； 弃上清，加入5ml DMEM高糖（含体积分数为10 %的胎牛血清）完全培养基，玻璃滴管混匀， 将细胞转入50ml细胞培养瓶中；37°C、体积分数为5%的C02培养箱中贴壁培养12小时；
[0025] B.倒掉瓶内培养液，用1ml DMEM培养液清洗细胞，清洗3次，然后玻璃滴管吸除 残余液体；在培养瓶中加入猪胰蛋白酶至质量分数为〇. 25% (10 μ Ι/cm2)，瓶底所有细胞均 能被胰酶覆盖；37°C培养箱中消化10分钟，细胞收缩、变圆，逐渐从培养瓶底部脱落；立即 加入5ml含5% FBS的DMEM培养基到细胞瓶中，玻璃滴管轻轻吹打，使团块细胞分散均匀， 然后在1200rpm/分钟条件下离心10分钟，加入DMHM培养基；血球计数板细胞计数，按照 1X 1〇5/孔的密度将细胞接种到24孔板中，于37°C、体积分数为5%的0)2培养箱中贴壁培 养12小时，然后按照1 X 107/孔的浓度将轮状病毒接种到细胞中，继续培养24小时；
[0026] C.倒掉旧培养基，加入新鲜的含体积分数为10% FBS的DMEM高糖培养基，加入重 组人IL-17至终浓度为2ng/ml，于37°C、体积分数为5%的C02培养箱中培养12小时；然后 在培养基中加入浓度为20ng/ml的重组人IL-26,继续培养24小时。实验过程中以添加等 量的PBS处理和添加 IL-17A或IL-26作为对照。接着，CCK-8检测细胞活性，荧光定量PCR 检测轮状病毒DNA含量，结果如图1和图2所示。结果显示，IL-17、IL-26细胞因子添加组 Caco-2细胞的活性显著强于细胞因子添加组和未添加组，同时轮状病毒DNA的数量也明显 低于单细胞因子添加组和未添加组，证实IL-17、IL-26双细胞因子显著抑制了轮状病毒的 复制，进而有效降低了病毒导致的细胞死亡率。其中，两种细胞因子处理组轮状病毒DNA的 浓度较未处理组降低约40 %，也比两种细胞因子单独处理组较低约20 %，可见两者的联合 应用有效抑制了轮状病毒在Caco-2细胞内的复制。
[0027] 本实施例为本发明的最佳实施例。其中CCK-8检测细胞活性检测方法如下：取对 照（PBS处理）组、轮状病毒感染对照组、轮状病毒感染后IL-17A、IL-26、IL-17A+IL-26处 理组的细胞，按照CCK-8试剂盒说明书，检测其细胞活性。荧光定量PCR检测轮状