IL-4R结合蛋白的 活性。还可W使用接头来为促调亡Bcl-2家族成员和IL-4R结合蛋白之间的连接部分提供了 不稳定性、酶切位点（例如蛋白酶的酶切位点）、稳定性序列、分子标签、可检测标签、或者它 们的各种组合。在一些实施方式中，可W在IL-4R结合蛋白（例如在CP分子中）或者促调亡 Bcl-2家族成员的两个域之间提供接头。
[0121] 所述接头可W具有双功能或者多功能，即，含有至少约第一反应官能团和第二反 应官能团，所述第一反应官能团位于所述接头的第一末端处或者位于所述接头的第一末端 的附近，能够结合至所述IL-4R结合蛋白或者被修饰成结合至所述IL-4R结合蛋白，所述第 二反应官能团位于所述接头的相反末端处或者位于所述接头的相反末端的附近，能够结合 至被修饰的所述促调亡Bcl-2家族成员或者被修饰成结合至被修饰的所述促调亡Bcl-2家 族成员。两个或者两个W上的所述官能团可W相同（即，所述接头具有同源双功能）或者它 们可W不同（即，所述接头具有异源双官能）。
[0122] 所述接头的长度和组成可W有相当大的变化。所述接头的长度和组成一般基于所 述接头的目标功能W及可选的其他因素例如合成的容易度、稳定性、耐受某些化学品的耐 受性和/或溫度参数W及生物相容性等考虑进行选择。例如，所述接头不应当对IL-4R结合 蛋白和/或促调亡Bd-2家族成员的活性造成显著的干扰。
[0123] 适合于在根据本公开内容的融合蛋白中使用的接头包括肤。可W使用重组DNA技 术将所述接头结合至IL-4R结合蛋白部分和/或促调亡Bcl-2家族成员部分。运些方法在本 领域中是已知的，并且运种技术的细节可W在例如Sambrook等，MoIecular Cloning: A Laboratory Manual.第二片反，Co Id Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press ,Cold Spring Harbor，N.Y.，1989或者Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，1994)或者其升级版中找到。
[0124] 所述接头肤可W具有I至500个氨基酸残基(例如I至100、1至50、6至30、1至40、1至 20、或者小于30个氨基酸或者5至10个氨基酸)的链长度。在一些实施方式中，接头的长度可 W为2、3、4、5、6、7、或者8个氨基酸，或者接头的长度可^为约10、20、30、40或者50个氨基 酸。
[0125] 通常，位于柔性蛋白区域的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser,并且运些氨基酸可W 用于接头序列。其他中性的氨基酸，例如化r和Ala,也可W用于所述接头序列。额外的氨基 酸可W被包括在所述接头中，从而在所述接头序列中提供独特的限制位点W便于构建融合 体。在一些实施方式中，接头可W例如包括氨基酸序列Gly-Ser(GS)或者可W是氨基酸序列 Gly-Ser(GS)或者可W包括泛素序列：
[0126] GGGSMQIFVRTLTGRTITLEVEPSDTIENVRARIQDREGIPPDQQRL1FAGRQLEDGRTLSDYNIQRESTLHLVLRL RGGGS(SEQ ID N0:28)或者其变体。适合于用作接头的泛素分子描述在例如Bachran，C.等 ('Anthrax toxin-mediated delivery of the Pseudomonas exotoxin A enzymatic domain to the cytosol of tumor cells via cleavable ubiquitin fusions''， MBio.2013Apr 30;4(3):e00201-13或者PCT公报WO/2012/139112中。
[0127]在一个实施例中，可W使用运样的肤接头，该肤接头容易受到具有蛋白水解活性 的补体系统的酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂、膜蛋白酶、纤维蛋白溶酶或者其他酶切 害d。根据另一个实施例，所述IL-4R结合蛋白可W通过容易受到具有蛋白水解活性的尿激 酶、组织型纤溶酶原激活剂、纤维蛋白溶酶、凝血酶或者膜蛋白酶切割的接头进行连接。另 夕h所述IL-4R结合蛋白可W通过二硫键(例如在半脫氨酸分子上的二硫键)而被连接到所 述促调亡Bcl-2家族成员。例如，在促调亡Bd-2家族蛋白的情况中，由于很多肿瘤天然地释 放高水平的谷脫甘肤(一种还原剂），因此运可能减少了二硫键，且随后在输送位点释放所 述促调亡Bd-2家族成员。
[01%]在一些实施方式中，根据本公开内容的融合蛋白可W包括促调亡Bcl-2家族成员 和通过可切割接头区域连接的IL-4R结合蛋白。在另一个实施方式中，所述可切割接头区域 可W是蛋白酶可切割接头，但是也可W使用可W由例如小分子切割的其他接头。蛋白酶切 割位点的示例包括那些被因子Xa、凝血酶和胶原蛋白酶切割的那些位点。在一个实施例中， 所述蛋白酶切割位点包括被与疾病相关联的蛋白酶切割的那些位点。在另一个实施例中， 所述蛋白酶切割位点是一般被与癌症相关联的或者被癌症上调的蛋白酶所切割的切割位 点。运种蛋白酶的示例有uPA、基质金属蛋白酶（MMP)家族、半脫氨酸天冬氨酸蛋白酶 (caspases)、弹性蛋白酶、前列腺特异性抗原(PSA，丝氨酸蛋白酶)和胞浆素原活化因子家 族W及成纤维细胞活化蛋白。在又一个实施例中，所述切割位点被由癌症相关联细胞分泌 的蛋白酶所切割。运些蛋白酶的示例包括基质金属蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝 血酶和uPA。在另一个实施例中，所述蛋白酶切割位点是被特定癌症上调或者与特定癌症相 关联的位点。精确序列可W在本领域中获得，并且本领域技术人员选择适当的切割位点是 没有困难的。举例来说，被因子Xa祀向的蛋白酶切割位点是IEGR。被肠激酶祀向的蛋白酶切 割区域是DDDDK。被凝血酶祀向的蛋白酶切割区域是LVPRG。在一个实施例中，可切割的接头 区域是被细胞内蛋白酶祀向的接头区域。
[0129] 所述接头可W使用本领域已知的常规技术连接至所述IL-4R结合蛋白部分和/或 促调亡Bd-2家族成员部分。
[0130] 比-4R结合蛋白/促调亡Bd-2家族融合蛋白的制备
[0131] 可W使用本领域已知的常规方法制备融合蛋白。可W例如通过使用重组DNA技术 改造编码所述融合蛋白的核酸或者通过肤合成制备融合蛋白W及对其进行的修饰。对所述 融合蛋白进行的修饰可W例如使用化学修饰和/或限制蛋白水解法通过修饰所述融合蛋白 多肤本身来进行。也可W使用运些方法的组合来制备所述融合蛋白。
[0132] 克隆和表达蛋白的方法在本领域中已知的，用于重组蛋白的表达的技术和系统的 详细说明可W在例如Current Protocols in Protein Science(Coligan，J.E.,等，Wileyfe Sons,New York)中找到。本领域技术人员应当理解的是，可W使用各种不同的表达系统来 提供重组蛋白。因此，所述融合蛋白可W在原核生物宿主(例如，大肠杆菌化.coli)、杀娃气 单胞菌(A.salmonicida)或者枯草芽抱杆菌(8.3山31:;[113))或者真核生物宿主(例如，酵母 菌（Saccharomyces)或者毕赤酵母（PicMa);哺乳动物细胞，例如C0S、NIH3T3、CH0、B皿、 293、或者海拉细胞化eLa cell);或者昆虫细胞(杆状病毒））中制得。所述融合蛋白可W使 用本领域已知的标准技术从宿主细胞中纯化。
[0133] 各种例示性的融合蛋白的序列提供在表1中。如果需要另外可选的序列，可W使用 标准技术（例如参见Ausubel等，Qirrent Protocols in Molecular Biology，Wiley&Sons， NY(1997and updates);Sambrook等，Sambrook,等Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory ,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring化rbor，N.Y. ,1989或者它们的升级版）克隆运些序列的变体和类似 物。例如可W从适当的生物体例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hyhwhila)通过提取mRNA然 后根据HiRNA模板(例如通过RT-PCR)合成CDNA或者从基因组DNA通过PCR扩增该基因直接获 得核酸序列。作为选择，编码IL-4R结合部分或者所述促调亡Bcl-2家族部分的核酸序列可 W通过标准程序从适当的CDNA文库获得。然后将分离的CDNA插入到适当的载体例如克隆载 体或者表达载体中。
[0134] 可W在特异性的预定位置通过本领域已知的体外定点诱变技术引入突变(如果需 要的话）。可W通过对构成编码序列的一个或者多个适当核巧酸的缺失、插入、取代、倒位或 者它们的组合来引入突变。
[0135] 所述表达载体可W进一步包括调控元件例如充分转录融合蛋白编码序列所需要 的转录元件。能够引入到载体中的调控元件的示例包括但不限于启动子、增强子、终止子和 多腺巧化信号序列。可W使用包括操作地连接至编码遗传改造的融合蛋白的核酸序列的调 控元件的载体来生成所述融合蛋白。
[0136] 所述表达载体还可W另外包括便于对表达的融合蛋白进行纯化的异源核酸序列， 例如亲和标签(如金属亲和标签、组氨酸标签、抗生物素/链霉亲和素编码序列、谷脫甘肤- S-转移酶(GST)编码序列、麦芽糖结合蛋白（MBP)编码序列或者生物素编码序列）。在一个实 施例中，所述标签被结合至融合蛋白的N末端或者C末端，或者可W定位在所述融合蛋白中。 所述标签可W在使用之前根据本领域已知的方法从表达的融合蛋白除去。可选的是，所述 标签可W保留在所述融合蛋白上，前提是它们不干扰所述融合蛋白的所希望的活性的能 力。
[0137] 所述融合蛋白可W根据需要和/或如本文所讨论的那样包括一个或者多个接头W 及其他部分。它们可W包括结合区域，例如抗生物素或者表位、或者可W用于纯化和加工所 述融合蛋白的多组氨酸标签等标签W及本文所述的其他接头。另外，可W将可检测的标记 物结合至所述融合蛋白，使得可W方便地监视所述融合蛋白通过身体或者细胞的运输。运 些标记物包括放射性核素、酶、巧光团、发色团W及类似的标记物。
[0138] 本领域技术人员应当理解的是，可W W很多种方式改变所述DNA而不影响编码蛋 白的生物学活性。例如，可W使用PCR来在编码所述融合蛋白的DNA序列中产生变化。编码融 合蛋白的DNA中的运些变化可W被用来对用于表达所述蛋白的宿主中的密码子偏好进行优 化，或者可W包含能够便于表达的其他序列变化。
[0139] 化-4R结合蛋白与促调亡Bcl-2家族成员的直接的共价连接或者通过接头的共价 连接可W如本领域已知的那样采取各种形式。例如，共价连接可W为二硫键的形式。编码所 述部分中的一个部分的所述DNA可W被改造成包含独特的半脫氨酸密码子。第二部分可W 使用与第一部分的半脫氨酸具有反应性的琉基进行衍生。可选的是，可W使用固相多肤技 术将琉基本身或者作为半脫氨酸的一部分引入。例如，根据Hiskey(Peptides 3:137,1981) 所述将琉基引入到肤中。
[0140] 分析
[0141] 可W使用本领域已知的或者本文描述的标准方法对融合蛋白进行分析。
[0142] 例如，可W使用适当的细胞(通常为表达标祀的细胞系或者癌症细胞)对所述融合 蛋白杀灭细胞或者抑制细胞的生长的能力进行体外分析。一般来说，使选用的测试细胞系 的细胞生长至适当的密度，并且添加候选的融合蛋白。可W将融合蛋白W约至少Ing/mL、至 少lug/mL、或者至少Img/mL，例如约0 .Olug/mL至约Img/mL、约0.1 Oug/血至约0.5mg/mL、约 Iug/血至约0.4mg/mL添加至培养物中。在一些实施例中，巧聯了系列稀释液。经过适当的溫 浴时间（例如约48小时至72小时）之后，评价细胞存活或者生长。确定细胞存活的方法在本 领域中是已知的，并且包括但不限于刃天青还原试验（参见Fields&Lancaster Am.Biotechno1.Lab.，11:48-50,1993!O'Brien等，Eur.J.Biochem.，267:5421-5426,2000 或者U.S.F*at.No.5,501,959)、横基罗丹明分析(Rubinstein等，J.化tl .Cancer Inst.，82: 113-118,1999)、或者中性红色染料测试化itano等，Euro. J.Clin. Investg. ,21:53-58， 1991;West等，J. Investigative Derm. ,99:95-100,1992)、或者台吩蓝分析。可W使用很多 可W商购获得的试剂盒，例如CeIlTi ter96饭AQueous One SoIut ion细胞增殖分析 (Promega)。通过比较被处理的培养物中的细胞存活和一个或者多个对照例如未处理的培 养物和/或使用对照化合物(通常是一种已知的治疗剂)预处理的培养物或者其他适当的对 照的细胞存活来确定细胞毒性。
[014；3]另外的分析法在例如 Cr ouch等（J . Immuno 1 .Meth. 160,81-8) ;Kangas 等 (Med.Biol.62,338-43,1984);Lundin等，（Meth.Enzymol.133,27-42,1986);Petty等 (Comparison of J.Biolum.Chemilum.10,29-34,1995);和Cree等(Anticancer Drugs 6: 398-404,1995)中有描述。细胞生活力可W使用各种方法，包括MTT(3-(4,5-二甲基嚷挫 基）-2,5二苯基四氮挫鐵漠化物）（Barhrop)Bioorg.&Med.化em丄ett. 1:611，1991 ;Co;ry 等，Cancer Comm.3,207-12，1991;Paull J.Hetero巧clic Qiem.25,911,1988)进行分析。 对细胞生活力的分析还可W商购获得。运些分析法包括但不限于CELLTITE民-GLO潑发 光细胞生活力分析(PromegaK其使用巧光素酶技术来检测ATP并且对培养物中的细胞的健 康或者数量进行量化)和CdlTiter-Gk)@Luminescent细胞生活力分析，运是一种乳酸盐脱 氨酶(LDH)细胞毒素分析(Promega)。
[0144]可W测试提供对特定类型的癌症具有的选择性的融合蛋白祀向该特定癌症细胞 类型的能力。例如，可W通过比较包含祀向显示I型或者II型的化-4R的细胞的特异性化-4 的融合蛋白杀灭癌症细胞的能力与杀灭正常细胞或者不同类型的癌症细胞(例如没有表达 I型或者II型的IL-4R的细胞）的能力来评价所述融合蛋白选择性地祀向所述细胞的能力。 作为选择，可W使用本领域已知的流式细胞计数法来确定包含I型或者II型受体特异性IL- 4的融合蛋白是否能够选择性地祀向特定类型的细胞。被标记的抗体与被结合的融合蛋白 的结合将指示融合蛋白与祀标的结合。
[0145] 类似地，用于测量细胞调亡的分析法在本领域中是已知的。调亡细胞通过特征性 的形态变化包括染色质凝聚、细胞收缩和膜起泡(运些可W使用光学显微镜清楚地看到)来 表征。调亡的生物学特征包括DNA片段化、特定位置的蛋白切割、增加的线粒体膜渗透性W 及细胞膜表面上的憐脂酷丝氨酸的出现。用于调亡的分析法在本领域中是已知的。例示性 的分析法包括TUNEL(末端脱氧核巧酸转移酶生物素-dUTP缺口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-加TP Nick End Labeling))分析法、半脫氨酸天 冬氨酸蛋白酶活性(特别是半脫氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)分析法和用于fas-配体和膜联蛋 白V的分析法。用于检测调亡的可W商购获得的产品包括例如Apo-ONE吸化mogeneous Caspase-3/7分析法、Fra姐L TU肥L试剂盒（0NC0GE肥 RESEARCH PRODUCTS，San Diego, Calif)、Apo化加 DNA片段化分析法(BIOVISION，Mountain View，Calif)、和快速调亡DNA梯 度检测试剂盒（Quick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit，BIOVISION，Mountain View，Calif)。
[0146] 适合于检测候选融合蛋白的各种细胞系在本领域中是已知的并且很多都可W通 过商购获得（例如，从美国典型培养物保藏中屯、（American Type Culture Collection)， Manassas，Va.商购获得）。类似地，动物模型在本领域中也是已知的并且很多动物模型都可 W商购获得。
[0147] 治疗适应症和应用
[0148] 包含如本文所述的IL-4R结合蛋白和促调亡Bcl-2家族成员的所述融合蛋白可W 被用于各种治疗用途。一般来说，本文所述的融合蛋白可W被用于设及表达IL-4R的细胞W 及将受益于对细胞增殖的抑制或者细胞死亡的促进的任意疾病、素乱或者病症的治疗或者 预防。在一些实施方式中，本文所述的融合蛋白可W被用于设及表达I型或者II型IL-4R的 细胞、W及其中相对于其他受体而选择一种类型的受体是有用的、W及将受益于对细胞增 殖的抑制或者细胞死亡的促进的任意疾病、素乱或者病症的治疗或者预防。
[0149] 在一些实施方式中，包括促调亡Bcl-2家族成员的融合蛋白可W被用来诱导调亡 或者细胞死亡、或者用来治疗与异常调亡或者细胞增殖相关联的素乱例如癌症。本文使用 的术语"癌症"、"癌"、"过度增生"或者"寶生物"是指具有自动生长的能力的细胞(例如，W 正在增殖的细胞生长激增为特征的异常状态或者情况）。过度增生性或者寶生性疾病状态 可W被分类为病理性