用于柑橘绿化枯萎病的发病定量系统和治疗方法
【专利说明】用于巧橘绿化枯萎病的发病定量系统和治疗方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年 10 月 30号提交的题为 "Pathogenesi S Quant if icat ion Systems and IYeatment Methods for Cihus Greening Bli曲t"的美国临时申请序列 No. 61 /897，626的优先权，所述申请的全部内容W引用的方式并入本文。 发明领域
[0003] 本发明尤其设及对宿主植物和哺乳动物致病的隧菌体和细菌的检测和控制。
[0004] 本发明在相橘绿化枯萎病kitrus greening bli曲t)(也称为黄龙病）巧LB)的背 景下进行例示，并且更通常设及基于根据双病原体:多重宿主定量比率或发病四分位数测 定致病指数的测试和治疗方法及组合物，所述致病指数被专口设计用于四分位数的诊断和 治疗，其次用于药物开发，并且作为用于鉴定药物候选物的研究工具。
[0005] 发明背景
[0006] 相橘绿化枯萎病(也称为黄龙病化LB))是遍及世界的相橘植物的致死疾病，其导 致被感染的树的显著果实损失和死亡。HLB感染影响树的叶片、哑枝和果实，最终导致整个 树的衰退。HLB的症状包括具瘤斑、具斑驳并具黄化脉纹的叶片，歪斜且小的绿色咸苦味果 实，哑枝梢枯，W及整个树发育迟缓并衰退。HLB的诊断由于下述事实而变得复杂:HLB的一 些症状与其它的树小病(包括营养缺乏）的症状类似。化B控制常常需要破坏被感染的树，所 述被感染的树可能甚至在被感染后数年也不显示HLB的症状。
[0007] 聚合酶链式反应诊断试验已鉴定出与HLB的症状相关联的主要病原体为细菌候选 初皮部杆菌属某些种（Candidatus Liberibacter SPP)，包括候选初皮部杆菌亚洲种 (Ca丄.asiati州S) (LAS)、候选初皮部杆菌非洲种（〔日丄.日化;[。日]1113)和候选初皮部杆菌美 洲种(化丄.americanus)物种。据信细菌损害营养素在相橘树的初皮部和叶茎中的传递，其 中怀疑植物病状是由营养缺乏所引起。假定的致病细菌的抗生素控制是被动的解决方案， 但对果园管理来说是昂贵的手段，其绝不可能是合理的解决方案。相橘中的候选初皮部杆 菌的低复制水平需要高灵敏度方法来检测它们的存在。已用来检测候选初皮部杆菌亚洲种 细菌的基于PCR的方法包括定性PCR测定（Saponari等，2013, J.Virol.Methods. 193(2): 478-86)和组织印迹诊断（化 geswara-Rao M.等，2013，Mol. Cell Probes. 27(5-6) !ness) ， 所述文献中 的每个 W 引用的方式并入本文。
[000引细菌隧菌体或隧菌体是感染细菌的病毒。大多数是DNA病毒。每种隧菌体仅攻击特 定物种或者在许多情况下仅攻击物种中的某些菌株。在结构上，细菌隧菌体或隧菌体由多 边形的头部和短直的尾部构成，所述头部由薄蛋白膜包裹的DNA组成，所述尾部由蛋白质组 成。然而，也已报道球形隧菌体和丝状隧菌体。细菌隧菌体的生活周期包括两个周期：营养 周期和溶源性周期。在营养周期中，隧菌体被称为烈性隧菌体，并且所述周期包括附着(吸 附）、穿入、隐蔽期、复制、组装和释放的步骤。在溶源性周期中，隧菌体被称为溫和隧菌体， 并且所述周期包括附着(吸附）、穿入、隐蔽期的步骤，并且随后与营养周期中的烈性隧菌体 不同，溫和隧菌体在隐蔽期之后不复制，相反，其整合到细菌染色体中并且潜伏一段时间。 整合的隧菌体现被称为原隧菌体，并且携带原隧菌体的细菌被称为溶源体。溶源体不被溶 解，而是与作为染色体的一部分的原隧菌体一起生长和增殖。溶源体可获得新的特性，并且 原隧菌体可恢复成烈性隧菌体并且被感染的细菌可W被溶解。细菌隧菌体的实际应用包括 但不限于细菌隧菌体分型、将细菌分类为隧菌体群、隧菌体溶源性转换、隧菌体疗法W及作 为克隆载体。
[0009]细菌隧菌体诸如与葡萄球菌（staphylococci)和肠共生的细菌粪肠球菌 化.faecalis)相关联的那些被认为是宿主细菌的生活周期中的重要因素，其可影响宿主的 致病性（Deghorain和Melderen ,2012, Viruses4 :3316-35 ; Duerkop等，PNAS 109(43): 17621-626)。对源自有化B症状的相橘的候选初皮部杆菌亚洲种基因组的分析已显示两个 环状隧菌体基因组 SCl和 SC2的存在（Zhang 等，20 11 ,Molecular Plant-Microbe Interactions 24(4):458-68)。对与相橘绿化病相关联的未培养的类细菌生物体(BLO)的 S个DNA片段(In-2.6、In-1.0和In-0.6)进行了克隆，并且核巧酸序列测定表明与相橘绿化 病相关联的未培养的化0的基因组含有nusG-rp化A化-rpoBC基因簇和细菌隧菌体型DNA聚 合酶的基因（Villechanoux等，1993 ,Curr Microbiol. 26(3): 161-6)，所述参考文献的全部 内容W引用的方式并入本文。对山木瓜初皮部杆菌BT-Ul化er化acter crescens BT-1)的 全基因组进行了测序，并且所述全基因组含有硫胺素和必需氨基酸生物合成方面的较多基 因，W及含有两个原隧菌体区域化eonard等，2012,Standards in Genomic Sciences 7: 271-83)，所述文献的全部内容W引用的方式并入本文。
[0010]鉴于前述，在本领域中仍然存在对化B诊断方法和根除方法及用于所述疾病的组 合物，W及用于病原体-致病的-宿主介导的疾病系统的更通常的诊断和治疗方法及组合物 的需要。
[00川发明概述
[0012] 本文所述的各种实施方案提供了一种用于诊断、预后、药物筛选的新型发病模型， 和可用于检测生物样品的发病的治疗方法和相关算法。在某些实施方案中，本发明提供了 一种用于检测生物样品的发病的方法，所述方法包括:a)定量样品中对第一生物体具有特 异性的核酸的量，所述第一生物体为与第二生物体相关联的病原体，其中运两种生物体接 连地感染宿主生物体W确定病原体定量测量值，b)定量样品中对响应于病原体的宿主生物 体具有特异性的核酸的量W确定与疾病的发病相关联的祀标的多重定量；W及C)计算双病 原体祀标的量相对于宿主定量测量值(meassures)的比率，其中所述比率提供了用于检测 发病的病原体指数。在某些实施方案中，较高的病原体指数指示较差的预后并且可用于药 物治疗效力和药物筛选。
[0013] 在某些实施方案中，通过使来自样品的核酸与核酸扩增反应中的第一组寡核巧酸 引物接触来进行样品中的对第一生物体具有特异性的核酸的定量，第一组寡核巧酸与第一 生物体的核酸至少部分互补，并且其中通过使来自样品的核酸与核酸扩增反应中的第二组 寡核巧酸引物接触来进行样品中的对第二生物体具有特异性的核酸的定量，第二组寡核巧 酸与第二生物体的核酸至少部分互补，并且还包括检测来自核酸扩增反应的扩增子，并且 其中通过使来自样品的核酸与核酸扩增反应中的第=组寡核巧酸引物接触来进行样品中 的对第=宿主生物体具有特异性的核酸的定量，第=组寡核巧酸与第=生物体的核酸至少 部分互补，并且还包括检测来自核酸扩增反应的扩增子，其中扩增反应发生在同一容器中， 并且基于扩增子的相对数目来计算病原体比率的量相对于宿主负载量的比率W导出病原 体指数或四分位数。如本文所用，病原生物体是病毒和细菌，并且宿主生物体是植物或动 物。当宿主生物体是细菌时，宿主还可驻留在另一宿主诸如植物或动物(例如人）内或与所 述另一宿主相关联。在某些实施方案中，发病是相橘绿化枯萎病或黄龙病化LB)，病原体或 第一生物体可W是细菌隧菌体或病毒，并且第二生物体是候选初皮部杆菌亚洲种(LAS)细 菌并且宿主是大量的结果类和非结果类植物。病原体指数还可源自与双病原体-宿主关系 在致病上紧密联系的任何诱导物或因子基因的另外相关性。
[0014] 在某些实施方案中，本发明的方法还包括与提供作为治疗策略的临床效用的病原 体指数或四分位数相关的报告算法。在一些实施方案中，本发明的方法还包括下述步骤:定 量样品中对病原生物体的诱导物具有特异性的核酸的量W确定诱导物负载量;并且其中病 原体指数和诱导物负载量与用于确定预后和提供作为治疗策略的临床效用的报告指数相 关。本发明的方法还提供的是，定量对病原生物体、宿主生物体或诱导物具有特异性的多种 独特核酸，并且所述多种独特核酸在报告指数中是相关的。
[0015] 本发明中定量的核酸包括但不限于RNA或DNA。在某些实施方案中，定量隧菌体RNA 和细菌DNA，并且计算隧菌体RNA与细菌DNA的比率W导出病原体指数。可通过现在已知或W 后发展的任何常规核酸检测反应来扩增核酸W用于相对定量测定，所述核酸检测反应包括 但不限于标准聚合酶链式反应(SPCR)、实时PCR、重组酶聚合酶扩增(RPA)、螺旋酶依赖性扩 增(HAD)、环介导的等溫扩增(LAMP)和切口酶扩增反应(NEAR)。
[0016] 在某些实施方案中，本发明提供了一种用于检测样品的发病(诸如相橘绿化枯萎 病化LB))的试剂盒，所述试剂盒包括:a)同于样品中的与第二生物体在致病上相关联的第 一病原生物体的核酸至少部分互补的至少第一组寡核巧酸，其中运两种病原体接连地感染 宿主生物体W确定病原体定量测量值;b)同于宿主生物体中的响应于疾病病原体的核酸至 少部分互补的至少第二组寡核巧酸;C)用于使用第一组寡核巧酸和第二组寡核巧酸的核酸 扩增反应的试剂;d)用于指导核酸扩增反应和检测其一种或多种扩增子的说明书；W及e) 用于计算扩增子的比率和/或双病原体祀标的量相对于宿主定量测量值的比率的说明书， 其中所述比率提供了用于发病(pathogeneis)(诸如相橘绿化枯萎病化LB))的检测、预后、 药物筛选和治疗策略或效力的病原体指数。
[0017] 本发明还提供一种用于筛选用于抑制或预防相橘绿化枯萎病的候选治疗剂的方 法。本发明的方法包括W下步骤:提供带有具有阻遏的隧菌体裂解周期的细菌隧菌体的候 选初皮部杆菌的培养物;将培养物与候选治疗剂候选物合并；W及检测候选初皮部杆菌培 养物的生长抑制，从而表明候选治疗剂抑制或预防相橘绿化枯萎病。在某些实施方案中，细 菌隧菌体是溶菌隧菌体，包括但不限于SCUSC2和SC3溶菌隧菌体，并且其中隧菌体裂解周 期被阻遏或遗传缺失。
[0018] 本发明还提供了一种用于治疗和/或预防细菌、植物或动物个体的细菌隧菌体或 病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的个体施用组合物，所述组合物包含有效量的选 自由W下组成的组的药剂:核巧、非核巧、核巧酸、非核巧酸、核糖核巧和选择性地抑制病毒 复制的核糖核巧类似物。在某些实施方案中，细菌隧菌体感染是在相橘树中的导致相橘绿 化枯萎病(诸如化B或LAS)的候选初皮部杆菌中。在某些实施方案中，使用抗病毒剂来治疗 和/或预防化B或LAS。本发明涵盖现在已知或W后发展的不同种类的抗病毒剂，包括但不限 于天然抗病毒化合物，诸如具有最大抗病毒活性的干扰素-a(IFN-a)和具有中等活性的干 扰素-e(iFN-e)，和合成抗病毒剂，所述合成抗病毒剂基于病毒复制周期中的作用点分为W 下组：1)核巧类似物，诸如阿昔洛韦(a巧clovirKACV)和其前药伐昔洛韦(valacyclovir)、 利己韦林(r：Lbavi;rin)、齐多夫定(zidovudin)和叠氮胸巧(azidothymidine) (AZT)，其阻断 病毒的核巧酸合成；2)核巧酸类似物，例如西多福韦（Cidofovir) (CDV)、更昔洛韦 (ganciclovir) (GCV)(或鄉更昔洛韦（valganciclovir))，其由于具有连接的憐酸基团而不 同于核巧类似物。核巧酸类似物可在细胞中持续较长时间段;3)非核巧类逆转录酶抑制剂， 例如奈韦拉平（nevirapine )，其结合逆转录酶；4)蛋白酶抑制剂，例如沙奎那韦 (saquinavir),其抑制病毒蛋白酶；W及5)其它类型，诸如金刚烧胺和金刚乙胺，其通过抑 制病毒脱壳来抑制流感病毒，和/或焦憐酸类似物麟酷甲酸(phosphonoformicKPFA，麟甲 酸），其抑制HIV中的逆转录酶和瘤疹病毒中的病毒聚合酶（参见，例如Bennett和Gotte， 2013,Viruses 5:54-86,the review aims to discuss strengths , limitations,and opportunities of the phage surrogate with emphasis placed on its utility in the discoveiT and development of ant;Lherpetic 化ugs)，所述文献的全部内容W引用 的方式并入本文。
[0019] 在某些实施方案中，抗病毒剂是ATP类似物，诸如2 脱氧-2 叠氮基腺巧5 ' -S憐 酸(AzTP)和/或2'-脱氧-2'-氣腺巧5'-^憐酸（*'1911〇9113*6)(4巧？），其通过大肠杆菌 化.coli )RNA聚合酶抑制RNA合成（IsMhama等，1980，J.Biochem. 87:825-30)，所述文献的 全部内容W引用的方式并入本文。在其它实施方案中，抗病毒剂是叠氮胸巧(AZT)，即胸巧 类似物3'-叠氮基-3'-脱氧胸巧（又叫作BW A509U)，其具有对抗肠杆菌科 化nterobacteriaceae)家族中的许多成员的强有力的细菌活性，并且AZT-S憐酸是复制型 DNA合成的最有力的抑制剂并且/或者是体外DNA聚合反应中的特异性DNA链终止子，运可解 释此化合物对抗易感微生物的致死特性化Iwell等，1987