一种测定杂交油菜新品种的特异性、一致性与稳定性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种测定杂交油菜新品种的特异性、一致性 与稳定性的方法。
【背景技术】
[0002] 作为一种特化的知识产权，植物新品种已经成为一个公司及至一个国家的核心竞 争力。植物新品种授权与相关法律问题的解决依赖于DUS测试，即对待测油菜品种的特异 性（Distinctness)、一致性（Uniformity)和稳定性（Stability)的田间种植鉴定或室内分 子标记鉴定。田间种植鉴定流程为：将待测油菜品种与近似品种同时植于田间，在2年及以 上的生长季节内，观察它们的多个性状，根据性状表现判断待测油菜品种与近似品种的差 异显著性，即特异性，同时判断群体内杂株比例，即一致性和稳定性；室内分子标记鉴定的 流程为：分单株提取待测油菜品种与近似品种中每个样本的DNA，并分别对每个样本的每 个测试区域进行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应），并对每个PCR产物进 行电泳或一代测序检测，根据检测结果，获得待测油菜品种与近似品种的差异位点比例，根 据差异位点比例，判断待测油菜品种的特异性。
[0003] 田间种植鉴定的缺点是：周期长、工作量大，环境影响性状，导致判断不准确。室内 分子标记鉴定的缺点是：需要分别处理每个样本的每个测试区域，工作量大，不能对样本与 测试区域大量抽样，无法计算杂株率，因而无法进行稳定性与一致性的测试。田间种植鉴定 与室内分子标记鉴定的共同缺点是：均由于工作量大的原因，无法从现有品种中客观选择 近似品种，只能由品种权申请人提供，而基于商业利益等动机，品种权申请人提供的近似品 种可能不真实，从而造成错误品种授权的法律后果。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中检测杂交油菜新品种特异性、一致性与稳定性不准确的问 题，本发明实施例提供了一种测定杂交油菜新品种的特异性、一致性与稳定性的方法。所述 技术方案如下：
[0005] 本发明实施例提供了一种测定杂交油菜新品种的特异性、一致性与稳定性的方 法，所述方法包括：
[0006] 获得不同油菜品种间的变异位点；
[0007] 通过所述变异位点确定所述待测油菜品种的测试区域，所述测试区域包括通用测 试区域，至少部分所述变异位点包含在所述通用测试区域内；
[0008] 构建包含所述不同品种的在所有所述测试区域的基因型的数据库；
[0009] 确定所述待测油菜品种的抽样量SN后，随机抽样混合并提取混合样本的DNA ;
[0010] 制备扩增所述测试区域的引物，所述引物包括所述通用测试区域引物；
[0011] 利用所述引物对所述混合样本的DNA进行扩增，得到所述测试区域的扩增产物， 所述扩增产物用于构建高通量测序文库；
[0012] 对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；
[0013] 分析所述测序片段组，获得待测油菜品种基因型和杂株基因型；
[0014] 将所述待测油菜品种基因型与所述数据库中的所述不同品种的基因型比较，获得 所述待测油菜品种的近似品种、变异位点和变异位点率；
[0015] 将所述杂株基因型与所述数据库中的所述不同品种的基因型比较，获得杂株品种 后，计算杂株率；
[0016] 利用所述变异位点、所述变异位点率和所述杂株率，判断所述待测油菜品种特异 性、一致性和稳定性。
[0017] 具体地，所述抽样量5抑茜足如下条件出預0^1阶^]?，0.95)/5^^彡1.15柳，其中 BINOM. INV为excel 2010中的函数，M为判断所述一致性和稳定性时所选用的阈值，所述抽 样量SN满足的条件含义为：即使所述杂株率只超出一致性和稳定性的判断阈值M的15%， 所述抽样量在95%的概率保证下，可正确判断所述待测油菜品种的稳定性与一致性。
[0018] 具体地，所述高通量测序的深度CF满足如下条件：BIN0M. DIST (10, 10, BI NOM. DIST(8, 20, BINOM. DIST(0, CF, 0. 1 %,TRUE),TRUE),FALSE) ^99.9 %, 1-BIN 0M. DIST (10000, 10000, 1-BIN0M. DIST (8, 20, 1-BIN0M. DIST (99. 99 %*CF, CF, 99. 9 989 %，TRUE)，TRUE)，FALSE)彡 0.1 % 且 BIN0M.DIST(10*(1-M)*CF，10*CF，1-110 % *M，TRUE)多95. 0 %，其中，CF为所述高通量测序的深度，M为判断所述一致性和稳定性时所 选用的阈值，BINOM. DIST为excel 2010中的函数，所述高通量测序的深度CF满足的条件 含义为：在所述杂株率低至〇. 1 %、所述杂株品种为10个且所述杂株品种与所述待测油菜 品种间平均仅有20个差异位点的条件下，由所述高通量测序的深度CF决定的检出全部所 述杂株品种的概率多99. 9% ;在所述数据库的品种为10000个且所述杂株品种与所述待测 油菜品种间平均仅有20个差异位点的条件下，由所述高通量测序的深度CF决定的存在误 判所述杂株品种的概率< 〇. 1% ;在所述杂株品种为10个且真实杂株率仅超过判断特异性 时所选用的阈值的10%时，由所述高通量测序的深度CF决定的对稳定性与一致性的判定 结论正确的概率彡95.0%。
[0019] 具体地，所述测试区域还包括非通用测试区域，所述引物还包括非通用测试区域 引物。
[0020] 进一步地，所述非通用测试区域引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物包 括第一正向引物和第一反向引物，所述第二引物包括第二正向引物和第二反向引物，所述 第一引物和所述第二引物分别进行单独扩增得到两个所述非通用测试区域的扩增产物，将 两个所述非通用测试区域的扩增产物等量混合用于构建单独扩增的高通量测序文库；
[0021] 所述第一正向引物的5'端连接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1，所述第 一反向引物中的5'端连接有如序列表中SEQ ID N0:2所示的序列2 ;
[0022] 所述第二正向引物的5'端连接有如序列表中SEQ ID N0:2所示的序列2,所述第 二反向引物的5'端连接有如序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列1。
[0023] 进一步地，利用所述变异位点、所述变异位点率和所述杂株率，判断所述待测油菜 品种特异性、一致性和稳定性的方法包括：
[0024]当所述变异位点率多SD或所述非通用测试区域存在所述变异位点时，所述待测 油菜品种具有特异性，当所述变异位点率< SD且所述变异位点不存在于所述非通用测试 区域时，所述待测油菜品种不具有特异性，其中SD为判断特异性时所选用的阈值；
[0025] 当所述待测油菜品种的所述杂株率< M时，所述待测油菜品种具有一致性和稳定 性，当所述待测油菜品种的所述杂株率大于> M时，所述待测油菜品种不具有一致性和稳 定性，M为判断所述一致性和稳定性时所选用的阈值；
[0026] 所述杂株率 R = Rl+R2-R3_R4+Rm，其中：
[0027]
【主权项】
1. 一种测定杂交油菜新品种的特异性、一致性与稳定性的方法，其特征在于，所述方法 包括： 获得不同油菜品种间的变异位点； 通过所述变异位点确定测试区域，所述测试区域包括通用测试区域，至少部分所述变 异位点包含在所述通用测试区域内； 构建包含所述不同油菜品种在所有所述测试区域的基因型的数据库； 确定待测油菜品种的抽样量SN后，随机抽样混合并提取混合样本的DNA; 制备扩增所述测试区域的引物，所述引物包括所述通用测试区域引物； 利用所述引物对所述混合样本的DNA进行扩增，得到所述测试区域的扩增产物，所述 扩增产物用于构建高通量测序文库； 对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组； 分析所述测序片段组，获得待测油菜品种基因型和杂株基因型； 将所述待测油菜品种基因型与所述数据库中的所述不同品种的基因型比较，获得所述 待测油菜品种的近似品种、变异位点和变异位点率； 将所述杂株基因型与所述数据库中的所述不同品种的基因型比较，获得杂株品种后， 计算杂株率； 利用所述变异位点、所述变异位点率和所述杂株率，判断所述待测油菜品种特异性、一 致性和稳定性。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抽样量SN满足如下条件；BINOM. INV(SN，M，0. 95)/SN《1. 15*M，其中BINOM.INV为excel2010 中的函数，M为判断所述一 致性和稳定性时所选用的阔值，所述抽样量SN满足的条件含义为；即使所述杂株率只超出 阔值M的15%，所述抽样量在95%的概率保证下，可正确判断所述待测油菜品种的稳定性 与一致性。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量测序的深度CF满足如下条 件；BINOM.DIST(10, 10,BINOM.DIST巧，20,BINOM.DIST(0,CF, 0. 1 %，TRUE)，TRUE)，FALS巧 >99. 9%，1-BINOM.DISTQOOOO, 10000, 1-BINOM.DIST(8, 20, 1-BINOM.DIST巧9. 99% *CF,C F，99.9989%，TRUE)，TRUE)，FALS巧《0.1%且BIN0M.DIST(10*(l-M)*CF，10*CF，l-110% *M，TR肥）> 95. 0 %，其中，CF为所述高通量测序的深度，M为判断所述一致性和稳定性时所 选用的阔值，BIN0M.DIST为excel2010中的函数，所述高通量测序的深度CF满足的条件 含义为：在所述杂株率低至0. 1 %、所述杂株品种为10个且所述杂株品种与所述待测油菜 品种间平均仅有20个差异位点的条件下，由所述高通量测序的深度CF决定的检出全部所 述杂株品种的概率> 99. 9% ;在所述数据库的品种为10000个且所述杂株品种与所述待测 油菜品种间平均仅有20个差异位点的条件下，由所述高通量测序的深度CF决定的存在误 判所述杂株品种的概率《0. 1% ;在所述杂株品种为10个