且真实杂株率仅超过判断特异性 时所选用的阔值的10%时，由所述高通量测序的深度CF决定的对稳定性与一致性的判定 结论正确的概率> 95.0%。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测试区域还包括非通用测试区域，所 述引物还包括非通用测试区域引物。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述非通用测试区域引物包括第一引物 和第二引物，所述第一引物包括第一正向引物和第一反向引物，所述第二引物包括第二正 向引物和第二反向引物，所述第一引物和所述第二引物分别进行单独扩增得到两个所述非 通用测试区域的扩增产物，将两个所述非通用测试区域的扩增产物等量混合用于构建单独 扩增的高通量测序文库； 所述第一正向引物的5'端连接有如序列表中SEQIDNO: 1所示的序列1，所述第一反 向引物中的5'端连接有如序列表中SEQIDN0:2所示的序列2 ; 所述第二正向引物的5'端连接有如序列表中SEQIDN0:2所示的序列2,所述第二反 向引物的5'端连接有如序列表中SEQIDNO: 1所示的序列1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用所述变异位点、所述变异位点率和所 述杂株率，判断所述待测油菜品种特异性、一致性和稳定性的方法包括； 当所述变异位点率>SD或所述非通用测试区域存在所述变异位点时，所述待测油菜 品种具有特异性，当所述变异位点率<SD且所述变异位点不存在于所述非通用测试区域 时，所述待测油菜品种不具有特异性，其中SD为判断特异性时所选用的阔值； 当所述待测油菜品种的所述杂株率《M时，所述待测油菜品种具有一致性和稳定性， 当所述待测油菜品种的所述杂株率大于>1时，所述待测油菜品种不具有一致性和稳定 性，M为判断所述一致性和稳定性时所选用的阔值； 所述杂株率R=Rl+R2-R3-R4+Rm，其中；
岸中，nl为细胞核杂株品种的数目，tl为 第il个所述细胞核杂株品种的所有特异杂株核基因型的数目，iljl为第il个所述细胞核 杂株品种的所有所述特异杂株核基因型按频率由低到高排序后，第jl个所述特异杂株核 基因型，Rliljl为第iljl个所述特异杂株核基因型的频率；R1为由杂株核基因型计算的所 述细胞核杂株品种的所述杂株率的总和，所述细胞核杂株品种的所述杂株率为去掉所述细 胞核杂株品种中最低的80%和最高的10%的所述特异杂株核基因型的频率后，剩余的所 述特异杂株核基因型的频率的平均值的2倍；
,其中，t2为除所述细胞核杂株品种拥有的所述杂 株核基因型之外的且频率> 0. 17%的所述杂株核基因型的数目，i2为除所述细胞核杂株 品种拥有的所述杂株核基因型之外的所有所述杂株核基因型按频率由低到高排序后，第i2 个所述杂株核基因型，R2i2为第i2个所述杂株核基因型的频率；R2是利用除所述细胞核杂 株品种拥有的所述杂株核基因型计算的所述杂株率，R2为去掉除所述细胞核杂株品种拥有 的所述杂株核基因型的频率中最低的80%和最高的10%的值后，剩余值的平均值的2倍；
，其中，n2为细胞质杂株品种的数目，R3i3 为第i3个所述细胞质杂株品种的所述杂株率，t3为第i3个所述细胞质杂株品种的所有 特异杂株质基因型的数目，i3j3为第i3个所述细胞质杂株品种的所有所述特异杂株质基 因型按频率由低到高排序后，第j3个所述特异杂株质基因型，R3i3j3为第i3j3个所述特 异杂株质基因型的频率；R3为由杂株质基因型计算的所述细胞质杂株品种的所述杂株率 的总和，所述细胞质杂株品种的杂株率为去掉所述细胞质杂株品种中最低的80 %和最高的 10%的所述特异杂株质基因型的频率后，剩余的所述特异杂株质基因型的频率的平均值；
，其中，t4为除所述细胞质杂株品种拥有的所述杂 株质基因型之外的且频率>0. 17%的所述杂株质基因型的数目，i4为除所述细胞质杂株 品种拥有的所述杂株质基因型之外的所有所述杂株质基因型按频率由低到高排序后，第i4 个所述杂株质基因型，R4i4为第i4个所述杂株质基因型的频率；R4是利用除所述细胞质杂 株品种拥有的所述杂株质基因型计算的所述杂株率，R4为去掉除所述细胞质杂株品种拥有 的所述杂株质基因型的频率中最低的80%和最高的10%的值后，剩余值的平均值；
其中，巧为杂种特异测试区域的数目；i5为第i5个所述杂种 特异测试区域；Rm巧为第巧个所述杂种特异测试区域中，母本基因型的频率；Rf巧为第巧 个所述杂种特异测试区域中，父本基因型的频率；Rm为母本自交的所述杂株率，Rm为所述 杂种特异测试区域中，所述母本基因型的频率与所述父本基因型的频率的差值的平均值； Into为取整函数； 所述细胞核杂株品种是指仅利用核基因型计算获得的所述杂株品种，所述细胞质杂株 品种是指仅利用质基因型计算获得的所述杂株品种；所述特异杂株核基因型是指仅为一个 所述细胞核杂株品种所有的所述杂株核基因型；所述特异杂株质基因型是指仅为一个所述 细胞质杂株品种所有的所述杂株质基因型；所述杂株核基因型是指所述杂株基因型为所述 核基因型；所述杂株质基因型是指所述杂株基因型为所述质基因型；在所述杂种特异测试 区域中，所述母本基因型与所述父本基因型不相同，所述母本基因型与所有所述细胞核杂 株品种的基因型不同，且所述父本基因型与所有所述细胞核杂株品种的基因型也不同；所 述母本基因型为所述待测油菜品种中，与母本的基因型相同的基因型；所述父本基因型为 所述待测油菜品种中，与父本的基因型相同的基因型； 所述核基因型指位于细胞核基因组上的基因型；所述质基因型是指位于细胞质基因组 上的基因型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括采用W下方式判 定所述待测油菜品种的一致性和稳定性的结论正确的概率为：当所述待测油菜品种 具有一致性和稳定性时，结论正确的概率>BIN0M.DIST(M*SN,SN,R,TRUE)地IN0M. DIST(ESeN*M,ESeN，R，TR肥）；当所述待测油菜品种不具有所述一致性和 稳定性时，结论正确的概率>BIN0M.DIST(a-M)巧N，SN, (1-R)，TRUE)地IN0M. DIST(ESeN*(l-M)，ESeN，1-R，TR肥）；其中，M为判断所述一致性和稳定性时所选用的阔 值，ESeN为所有用于计算所述杂株率R的基因型的频率所在所述测试区域的测序片段的 总和，BIN0M.DIST(M*SN，SN，R，TR肥）为所述待测油菜品种进行了SN次抽样，实际抽得的所 述杂株率R小于所述阔值M的概率，BIN0M.DIST(ESeN*M，ESeN,R，TR肥）的意义为；对所 述待测油菜品种进行了ESeN次抽样，实际抽得的所述杂株率R小于阔值M的概率；BIN0M. DIST(a-M)巧N，SN，（1-R)，TR肥）为所述待测油菜品种进行了SN次抽样，实际抽得的所述 杂株率R大于所述阔值M的概率，BINOM.DIST(ESeN* (1-M)，ESeN，1-R，TR肥）的意义为； 对所述待测油菜品种进行了ESeN次抽样，实际抽得的所述杂株率R大于阔值M的概率，所 述基因型的频率是指所述测序片段组中，代表所述基因型的测序片段数占所述基因型所在 所述测试区域的测序片段总数的比例。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当所述非通用测试区域不存在 所述变异位点时，若判断所述待测油菜品种具有特异性，结论正确的概率>BIN0M. DIST((1-SD)*TRN，TRN，1-0D，TR肥）；若判断所述待测油菜品种不具有特异性，结论正确的 概率>BIN0M.DIST(SD*TRN，TRN，0D，TR肥），其中，TRN为检测成功的测试区域的数目，0D为 所述变异位点率，BIN0M.DIST为excel2010中的函数，所述结论正确的概率表示为当判断 所述待测油菜品种具有特异性时，所述变异位点率大于SD的概率，当判断所述待测油菜品 种不具有特异性时，所述变异位点率小于SD的概率，所述检测成功的测试区域通过分析所 述测序片段组后获得。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获得所述杂株品种的方法包括；所述杂株 品种为存在于所述数据库中的品种，且所述杂株品种的潜在杂株基因型与所述杂株基因型 间有相同基因型的所述测试区域的数目占所述杂株品种具有所述潜在杂株基因型的所述 测试区域的总数的比例> 60% ;所述杂株基因型指频率> 0. 02%的所述潜在杂株基因型； 所述潜在杂株基因型与所述待测油菜品种的所有基因型间的差异碱基的数量> 2个 或所述差异碱基中有非连续碱基的插入或缺失。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过所述变异位点确定所述通用测试区 域的方法为；通过区分度
L计算区分度的值，其中，a为变异窗口区域中被 检测到的品种总数，bi为所述变异窗口区域中第i种基因型的品种数，且bi〉l，k为包含大 于1个品种的基因型的数目，所述变异窗口区域为W每个单核巧酸变异位点为中屯、，向所 述单核巧酸变异位点的两侧各延伸测序列长度的1/2作为检测的窗口； 所述通用测试区域为细胞质基因组上区分度大的区域或细胞核基因组上所述区分度 大且均匀分布的区域。
【专利摘要】本发明公开了一种测定杂交油菜新品种的特异性、一致性与稳定性的方法。该方法包括：获得变异位点；确定待测油菜品种的测试区域；构建数据库；确定抽样量后，随机抽样混合并提取混合样本的DNA；制备引物；利用引物对混合样本的DNA进行扩增，扩增产物用于构建高通量测序文库；对高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；分析测序片段组，获得待测油菜品种基因型和杂株基因型；比较获得近似品种、变异位点和变异位点率；获得杂株品种后，计算杂株率；利用变异位点、变异位点率和杂株率，判断待测油菜品种特异性、一致性和稳定性。所述方法能够准确、完整地判断待测油菜品种的特异性、稳定性与一致性，且测试速度更快。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104846076
【申请号】CN201510148678
【发明人】方治伟, 彭海, 陈红霖, 程须珍, 陈利红, 周俊飞, 李甜甜, 高利芬, 卢龙, 章伟雄, 张继, 任毅, 陈斌, 李论, 胡长峰
【申请人】江汉大学, 中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年3月31日