鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重pcr试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种PCR试剂盒及检测方法，特别是涉及一种鉴别我国南疆3种常见 蛉种（长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉）的多重PCR试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 白蛉属于双翅目毛蛉科白蛉亚科（Phlebotominae)，是一类体小多毛的吸血昆虫， 全世界已知800多种，其中约10%蛉种已被证实可传播利什曼病等多种疾病。特定的蛉种 只能传播特定种类的利什曼原虫，不同蛉种有不同的生物学特征，对应有不同的控制策略。 传统形态学种类鉴定存在很大局限性，受发育状态的限制，白蛉主要是根据成虫的内部解 剖结构、外部形态，或者雄虫外生殖器的形态特征进行物种鉴定，卵、幼虫、蛹等非成虫虫态 一般不能鉴定。肢体残缺的种类就很容易造成种类鉴定不准确或者根本无法鉴定。而且培 养一个传统的分类工作者往往需要数年的专业培训，不断缩减的分类学家队伍，使分类学 发展面临巨大的挑战。
[0003] 然而，分子生物学鉴定方法更为方便简单，在物种鉴定方面显示了独特的优势。目 前已被广泛应用于昆虫物种的鉴定，但目前我国传统蛉种鉴别方法存在不足，迫切需要新 型分子生物学蛉种鉴别方法的出现。
[0004] 目前南疆是我国内脏利什曼病病例最多的地区，占全国病例一半以上。分布于南 疆的蛉种有长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉以及微小司蛉新疆亚种。长管白蛉、吴氏白 蛉、亚历山大白蛉均为我国内脏利什曼病传播媒介，微小司蛉新疆亚种为野生野栖蛉种，非 内脏利什曼病传播媒介，近年南疆黑热病媒介调查显示该蛉种占当地蛉种组成较小，不足 0. 1%，故不做常见蛉种研究。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种鉴别我国南疆3种常见蛉种（长管白蛉、吴 氏白蛉、亚历山大白蛉）的多重PCR试剂盒及检测方法。本发明基于我国南疆3种常见蛉 种C0I基因序列的差异，设计了多重PCR试剂盒及检测方法，而且该方法可靠、简便、易行， 可用于我国南疆3种常见蛉种的鉴定。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒，包 括：
[0007] (1)鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR通用的正向引物，其序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0008] (2)鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR通用的反向引物，其为SEQ ID NO. 2所 示的序列、SEQ ID NO. 3所示的序列和SEQ ID NO. 4所示的序列；
[0009] 其中，我国南疆3种常见蛉种包括：长管白蛉（Ph. longiductus)、吴氏白蛉（Ph. wui)和亚历山大白蛉（Ph.Alexandri)。
[0010] 进一步的，所述试剂盒还包括：聚合酶链式反应试剂。其中，所述聚合酶链式反应 试剂，可包括：
[0011]1)聚合酶链式反应缓沖液（即1〇 x PCR缓冲液）；
[0012] 2)四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs)，四种脱氧核糖核苷酸的浓度均为2. 5mmol/L ;
[0013] 3)牛血清白蛋白（BSA)，其为40mg/mL ;
[0014] 4)ExTaq 酶，其浓度为 5U/iiL;
[0015] 5)灭菌双蒸水。
[0016] 进一步的，所述聚合酶链式反应缓沖液的成份如下：
[0017] Tris-HCl 100mmol/L
[0018] KC1 500mmol/L
[0019] MgCl2 15mmol/L〇
[0020] 进一步的，所述试剂盒中的正向引物、SEQ ID NO. 2所示的序列、SEQ ID NO. 3所示 的序列和SEQ ID NO. 4所示的序列的浓度均为10μmol/L。
[0021] 另外，本发明还公开了一种利用上述试剂盒进行鉴别我国南疆3种常见蛉种的多 重PCR方法，其步骤包括：
[0022] (1)按照常规方法（如采用DNA提取试剂盒），提取我国南疆3种常见蛉种的DNA， 作为DNA模板；
[0023] (2)利用上述的试剂盒，将提取的DNA (DNA模板）在PCR扩增仪上进行扩增；
[0024] (3)对扩增的产物进行电泳鉴别。
[0025] 所述步骤（2)中，扩增中的反应体系如下：
[0026] 聚合酶链式反应缓沖液51^、2.5臟〇1/1(^吓84111、1011111〇1/1的如5￡0 10勵.1 所示的正向引物3.01^、1011111〇1/1的如5￡0 10肌2所示的序列1111、1011111〇1/1的如 SEQ ID N0. 3 所示的序列 1 ii L、10μmol/L 的如 SEQ ID N0. 4 所示的序列 1 ii L、40mg/mL 牛 血清白蛋白1 U L、5U/ii L ExTaq聚合酶0. 36 ii L、DNA模板1. 5 ii L，用灭菌双蒸水补足体积 至 50 ii L ;
[0027] 扩增中的反应条件如下：
[0028] 95°C 3min ;95°C 25s，54°C 20s，72°C 30s，共 37 个循环；72°C延伸 7min。
[0029] 所述步骤⑶中，电泳的条件为：采用1. 5g/100mL~2g/100mL的琼脂糖凝胶进行 电泳。
[0030] 所述步骤（3)中，鉴别的方法如下：
[0031] 长管白蛉的PCR扩增片段的长度可为248bp，吴氏白蛉的PCR扩增片段的长度可为 632bp，亚历山大白蛉的PCR扩增片段的长度可为395bp。
[0032] 再者，本发明还提供了上述试剂盒在鉴别长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉中的 应用。
[0033] 本发明和已有传统形态学鉴定方法相比较，其效果是积极和明显的，解决了传统 形态学种类鉴定存在的局限性，而且本发明的方法可靠、简便、易行，对我国南疆3种常见 岭种的鉴定具有积极意义。
【附图说明】
[0034] 下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明：
[0035] 图1是采用本发明的试剂盒鉴别长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉的结果图；其 中,M:标记（DNA Marker II) ;1_2:阴性对照（ddH20) ;3_6:亚历山大白蛉（Ph. Alexandri);7-10:吴氏白岭（Ph.wui) 长管白岭（Ph.longiductus)。
【具体实施方式】
[0036] 以下的试剂如未特别说明，则为商业化产品。
[0037] 实施例1试剂盒的制备
[0038] 本发明的鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒，其组分如下：
[0039] 1) 10μmol/L 正向引物 PFU :5' -AITCAACTAAACATAAAGATATTGGAAC-3'（如 SEQ ID NO. 1所示）
[0040] 2)1〇11111〇1/1反向引物，其具体如下：
[0041] 10μmol/L 的如 SEQ ID N0. 2 所示的序列、10μmol/L 的如 SEQ ID N0. 3 所示的序 列和10μmol/L的如SEQ ID NO. 4所示的序列。
[0042] Ph. longiductus 反向引物：5, -GGGGACCTAAGTATTAAGGGGATA-3,（SEQ ID NO. 2)
[0043] Ph. wui 反向引物：5' -GAAGTATTTAAATTACGGTCTGTTCAAAG-3'（SEQ ID NO. 3)
[0044] Ph. Alexandri 反向引物：5, -CCATGAGCAATATTTCTTGATAAT-3,（SEQ ID NO. 4)
[0045] 将组分1)、2)的引物