一种猕猴桃自然杂交种质的发掘与新品种培育方法
【专利摘要】本发明公开了一种猕猴桃自然杂交种质的发掘与新品种培育方法，涉及植物遗传育种和生物【技术领域】。本方法是：①调查猕猴桃属植物自然重叠分布区物种混生居群的分布情况并采集样本；②利用分子标记分析辅助定位杂交带居群；③采集杂交带的种质并在育种园中进行人工驯化；④对人工驯化获得的优株或优系进行品评和大面积区试；⑤注册申请新品种。本发明相比传统的人工杂交育种可以大大缩短育种年限；缩减了目标杂交种质发掘的地理区域，可以克服传统猕猴桃自然种质利用中的盲目性和随机性；可以筛选驯化出传统人工育种所不能预期得到的奇异种质；也不存在生物安全性问题。
【专利说明】一种猕猴桃自然杂交种质的发掘与新品种培育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物遗传育种和生物【技术领域】，尤其涉及一种猕猴桃自然杂交种质的发掘与新品种培育方法。具体涉及猕猴桃属植物不同物种间自然重叠分布区种质资源的遗传评价，利用分子标记技术辅助种内(间)自然杂交带居群的定位，优异自然杂交种质的发掘和人工育种园栽培驯化，以及最后的新品种培育和发布。
【背景技术】
[0002]猕猴桃(Actinidia Lindl.)是一种20世纪初开始人工驯化栽培的水果，至今仅有100余年的历史。猕猴桃以其独特的风味，富含维生素C、膳食纤维、多种矿物质营养和清肠健胃等功效而得到广泛青睐，成为新兴水果的典型代表之一。自1904年新西兰从中国引种猕猴桃并于1930年建立第一个栽培果园以来，猕猴桃人工栽培迅速扩大。20世纪70年代末，猕猴桃商业化栽培在全国展开，迄今全球栽培面积达到15.8万公顷，年产量达180万吨之多(Bolrose, Inc.2011.World kiwifruit review.A Publicat1n of Belrosej Inc.)。我国是世界商业猕猴桃的产销大国，目前中国猕猴桃的栽培面积约7.0万公顷，占世界栽培总面积的约44%，已经远远超过了意大利、新西兰和智利。在全球猕猴桃的总产量中，我国年产量约50万吨，占27.8%，成为世界最大的生产国。
[0003]尽管如此，目前我国及世界猕猴桃产业仍然存在品种单一老化、大多数品种的适应性和抗病抗逆性差和果实品质参差不齐等问题，严重阻碍了猕猴桃产业的健康和可持续发展，培育高产优质甚至奇异独特的猕猴桃新品种仍然是当前猕猴桃产业发展的关键。
[0004]我国是猕猴桃属植物的分布中心和野生资源大国。在猕猴桃属植物54个物种中，除了尼泊尔猕猴桃和白背叶猕猴桃为周边国家特有外，其他的绝大多数物种为中国特有。根据我国猕猴桃的地理分布，整体上可以划分为六大区域:西南地区(云南、贵州、四川西部和南部、西藏)、华南地区(广东、海南、广西和湖南南部)、华中地区(湖北、四川东部、重庆、湖南西部、河南南部和西南部、甘肃南部、安徽和陕西南部)、华东和东南地区(江苏、浙江、江西、福建和台湾)、华北地区(河北、山东、山西、北京和天津)和东北地区(辽宁、吉林和黑龙江)等。其中，每一个区域中都存在不同类型猕猴桃物(变)种的广泛自然重叠分布:例如华中地区包括了中华猕猴桃、美味猕猴桃、湖北猕猴桃、漓江猕猴桃、大花猕猴桃和毛叶硬齿猕猴桃等多个物种的重叠分布；而华南区则主要包括了毛花猕猴桃、阔叶猕猴桃、黄毛猕猴桃和安息香猕猴桃等类群的重叠分布。由于猕猴桃属植物是典型的雌雄异株多年生植物，极易产生种间(内)杂交并形成网状进化。因此，猕猴桃物种的自然重叠分布区提供了大量的机会供其产生自然杂交渐渗，从而极具潜力孕育出性状特征各异且适应性强的优异猕猴桃遗传种质。然而，迄今为止，仍然缺乏对这些猕猴桃重叠分布区的自然杂交带进行有效识别定位的方法，从而较大程度地阻碍了对其优异杂交种质的发掘利用。
[0005]人工杂交育种技术广泛应用于现代农业作物的遗传育种中。相比传统育种技术，杂交育种可充分利用杂交优势带来的好处，在增加农作物的产量品质和抗病抗逆性上具有不可替代的作用。对于猕猴桃，其较长的生长周期和复杂的生物学特性使得人工杂交耗时费力且往往得不到期望的结果。相反，猕猴桃自然杂交种质经过千百年的自然杂交渐渗和适应性进化，往往具有更加多样化的农艺特征性状和抗病抗逆性，对这些资源进行充分的发掘利用是现代猕猴桃遗传育种的重要方向之一。虽然目前发布的部分猕猴桃栽培品种也直接或者间接来源于自然种质资源，但前期的发掘工作具有很大的随机性和盲目性，并没有形成系统完整的方法供后续猕猴桃遗传育种利用，特别是对于自然杂交种质资源的发掘利用，仍缺乏方便快捷且行之有效的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种猕猴桃自然杂交种质的发掘与新品种培育方法。
[0007]本发明的目的是这样实现的:
[0008]一、方法
[0009]通过对不同猕猴桃自然重叠分布区种质进行居群遗传评价和分子标记辅助杂交带居群定位，缩小优异种质发掘的目标范围，在此基础上，结合传统的育种园人工培育驯化和进一步的筛选，形成可商业化利用的猕猴桃新品种。
[0010]其技术方案包括猕猴桃属植物自然重叠分布区物种混生居群调查和样本采集，基于分子标记分析辅助杂交带居群定位，杂交种质采集和育种园驯化，杂交优(株)系的品评区试和新品种发布。
[0011]具体地，本方法包括下列步骤:
[0012]①调查猕猴桃属植物自然重叠分布区物种混生居群的分布情况并采集样本；
[0013]②利用分子标记分析辅助定位杂交带居群；
[0014]③采集杂交带的种质并在育种园中进行人工驯化；
[0015]④对人工驯化获得的优株或优系进行品评和大面积区试；
[0016]⑤注册申请新品种。
[0017]二、应用
[0018]基于该方法的应用:筛选培育出各类猕猴桃自然杂交种质优株十多份，其中优株7-11-4，区试表明该优株果实品质综合性状突出，如平均果重可达75-85g、果肉黄色、肉质细嫩、风味酸甜适口等，且具有玫瑰红色花、花期早，抗逆性强等特点，是兼具观赏和鲜食于一体的优异自然杂交种质。在区试稳定的基础上，对7-11-4优株进行了省级林木品种审定和农业部新品种保护。
[0019]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0020]①相比传统的人工杂交育种可以大大缩短育种年限；
[0021 ] ②缩减了目标杂交种质发掘的地理区域，可以克服传统猕猴桃自然种质利用中的盲目性和随机性；
[0022]③充分利用猕猴桃自然杂交的复杂性、随机性和创造性，可以筛选驯化出传统人工育种所不能预期得到的奇异种质；
[0023]④育种园人工驯化和区试仅用于鉴定优异株系相应特征性状的稳定性，而不涉及任何人工遗传修饰，可以最大程度地保持自然杂交种质丰富的遗传基础，相应的新品种发布也不存在生物安全性问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本方法流程图；
[0025]图2为基于该方法筛选出的杂交种质优株‘7-11-4’的结果状图；
[0026]图3为基于该方法筛选出的杂交种质优株‘7-11-4’的花形态图；
[0027]图4为基于该方法筛选出的杂交种质优株‘7-11-4’的果实剖面图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图和实施例详细说明:
[0029]一、方法
[0030]1、如图1步骤①调查猕猴桃属植物自然重叠分布区物种混生居群的分布情况并采集样本，主要是根据现有的中国猕猴桃属植物的六大地理分布区域，依据不同物种的地理分布和资源调查确定主要的物种混生居群(> 2个物种或者变种)，物种的鉴定依照国际通用的称猴桃 UPOV(Un1n for the Protect1n of New Varieties of Plants, http://www.upov.1nt/genie/en/details, jsp ? id = 101)描述指标。在每个主要调查的地理区域内筛选10个以上的混生居群共后续的分子标记遗传分析和杂交带识别。混生居群的代表性样本采集方式为:每个居群采集30份以上的样本，且涵盖该居群混生的所有物种类群，其中每个物种至少5份以上。
[0031]具体的实施例内容:基于我国猕猴桃属植物的6个主要地理分布区域(西南地区、华南地区、华中地区、华东南地区、华北地区和东北地区)，根据猕猴桃属植物的每个物种的分布范围，确定相应的主要物种重叠分布区和多物种混生居群。本实施例共确定多物种混生居群(分布区)40个，分布区涵盖华中地区、华南地区和西南地区。基于猕猴桃UPOV标准相关于果实、叶片和枝条的15个易观察形态描述特征，总共鉴定出涉及这些混生的物(变)种数为10个，包括中华猕猴桃变种、美味猕猴桃变种、毛花猕猴桃、阔叶猕猴桃、京梨猕猴桃、黄毛猕猴桃、金花猕猴桃、软枣猕猴桃、黑蕊猕猴桃和大籽猕猴桃。在所确定的这些混生居群中，每个居群至少混合分布2种不同的猕猴桃，居群最多混生的猕猴桃物种数为5种。
[0032]对所确定的40个混生居群进行代表性样本的采集，每个居群采集样本至少30份，同时对单一居群涉及到的物种，每个物种至少保证5个代表性的样本。本实施例的样本采集在所调查年的8-10月份完成，此段时间果实等形态特征最清晰，物种易于辨认区分。总共40个居群采集代表性样本1500份，平均每个混生居群采集样本37.5份。根据植物自然杂交带分布的潜在规律(单峰或双峰模型)，每个混生居群中的采样依据一定的线性轨迹随机采集。样本的采集主要用于分子标记遗传分析。利用全球卫星定位系统对每一个采集的样本进行经纬度和海拔的三维定位，方便后续的补样和种质持续采集。对于每一个采集的样本，新鲜叶片立即埋入密封硅胶袋干燥保存。
[0033]2、如图1步骤②利用分子标记分析辅助定位杂交带居群，是指利用分子标记技术对所采集的样本进行居群基因组多标记位点的群体遗传学分析。在此基础上利用生物信息软件识别鉴定物种混生居群是否存在自然杂交渐渗现象。如果存在，则将其所在的地理位置定位为自然杂交带区域。
[0034]具体的实施例内容:首先对干燥保存的猕猴桃样本叶片进行基因组总DNA提取和分子标记实验。DNA提取步骤包括:取50-100mg硅胶干燥保存的叶片组织样本，在液氮中充分研磨，将粉末转移至1.5mL离心管，然后用植物细胞核裂解液在65oC水浴中充分裂解细胞核至少30分钟，经过氯仿分层和异丙醇沉淀以及75%乙醇洗涤，最后将获取的基因组总DNA溶解于50uL的I X TE溶液中。DNA溶液通过凝胶电泳和紫外分光光度计检测其质量和产量，达到分子标记试验要求，随即储存备用；分子标记分析步骤包括基因组DNA模板的EcoR I和Mse I双酶切、人工接头连接到酶切片段、对应引物的PCR预扩增和选择性扩增。本实施例采用对EcoR I引物5’端进行FAM荧光标记，将选择性PCR扩增产物上样到ABI 3730XL自动测序仪上进行条带分型。所有样本的分析结果共检测遗传位点350个，扩增条带的平均多态性位点百分比为90%以上。
[0035]本实施例的杂交带居群定位采用基于分子标记数据的STRUCTURE软件进行。其具体的实施方法为:将所有40个居群的样本的分子标记指纹数据整合成一个完整的数据表并转换成适用于STRUCTURE软件分析的数据输入格式，缺失的数据输入“-1”。软件参数优化的设置为:采用Admixture混合模型，开启独立等位基因频率选项，其他的使用默认值。将预评估的K值(所分析样本中潜在的不同的基因组遗传类型)设置成所分析居群样本包含的物种数目(如包括两个物种，则K = 2)，分析时贝叶斯的迭代数为1000，000,其中初始的50，000个迭代数据不收集。依据K值，在STURCTURE软件中评估鉴定每一个居群样本基因组的混合情况，即是否存在自然杂交渐渗(自然杂合子样本)。本实施例对40个所分析的居群样本共探测出27个居群分别属于4个潜在的大杂交带区域，即雪峰山区域、秦岭区域、大巴山区域和幕阜山区域。
[0036]3、如图1步骤③采集杂交带的种质并在育种园中进行人工驯化，即基于定位的杂交带居群，根据主要农艺目标性状挑选采集杂交带居群中的杂交种质并繁育于猕猴桃人工育种园进行驯化(包括嫁接和种子实生苗繁殖方式)。
[0037]具体的实施例内容:根据定位的杂交带居群(区域)，本实施例先后分3年在所定位的杂交带居群进行了相应的野生杂交种质资源的采集和育种园保存。主要采用的方式为:在猕猴桃最易于嫁接的时期即春季伤流期之前到所定位的杂交带居群进行种质枝条采集，可根据实际需要和备用砧木的多少决定采集的数量，本实施例每个居群采集的枝条约40份，嫁接在国家猕猴桃种质资源圃(武汉)育种园。另外，在9-10月份果实充分成熟的季节，到杂交带居群进行种子采集。选择充分成熟的果实种子，清洗后放在室内摊薄晾干，然后用塑料袋密封后放入4°C冰箱贮藏约5周后，再经16小时21°C和8小时10°C的温度变化处理，最终于当年12月至次年I月播种育苗。本实施例总共保存了杂交带种质(嫁接株系和后代实生苗)500余份。
[0038]4、如图1步骤④对人工驯化获得的优株或优系进行品评和大面积区试，即在育种园驯化的基础上，通过主要性状和适应性不同区域的稳定性试验，挑选优异株系开展区域性栽培试验。
[0039]具体的实施例内容:在杂交带居群种质收集保存并经过至少3年的育种园驯化适应的基础上，依据猕猴桃UPOV标准进行优株的筛选，筛选程序根据不同的育种预设目标进行。本实施例涉及花形态、花期、花色、平均果重、果肉颜色、可溶性固形物含量、总糖和总酸含量、Vc含量、果实贮藏性、抗逆性等多个性状指标的筛选评价，从收集保存的种质中总共筛选出单个特征突出或者综合性状优良的株系185份。对筛选的优株进行多地区试品评，本实施例区试分别于2008年冬季和2010年春季在湖北建始县花坪镇、江苏苏州市黄埭镇和四川彭州小渔洞镇等进行，采取定植幼苗和高接在四年生大树方式。经多年多点对母树和多代子代观察，筛选性状优良且稳定遗传的品系十多份。
[0040]5、如图1步骤⑤注册申请新品种，即在各方面指标评价合格和区试稳定的基础上，依照国家相应的动植物品种保护程序注册发布新品种。【具体实施方式】此处从略。
[0041]二、应用
[0042]基于该方法，本实施例筛选培育出优株7-11-4，区试表明该优株果实品质综合性状突出，如平均果重可达75-85g、果肉黄色、肉质细嫩、风味酸甜适口等，且具有玫瑰红色花、花期早，抗逆性强等特点，是兼具观赏和鲜食于一体的优异杂交种质(表1和2)。在区试稳定的基础上，本实施例对7-11-4优株进行了省级林木品种审定和农业部新品种保护。
[0043]表1筛选的7-11-4优株与猕猴桃主要栽培品种或物种的特征比较
[0044]
【权利要求】
1.一种猕猴桃自然杂交种质的发掘与新品种培育方法，其特征在于: ①调查猕猴桃属植物自然重叠分布区物种混生居群的分布情况并采集样本； ②利用分子标记分析辅助定位杂交带居群； ③采集杂交带的种质并在育种园中进行人工驯化； ④对人工驯化获得的优株或优系进行品评和大面积区试； ⑤注册申请新品种。
2.按权利要求1所述猕猴桃自然杂交种质的发掘与新品种培育方法的应用，其特征在于: 筛选培育出的猕猴桃自然杂交优异种质和新品种。
【文档编号】A01H1/02GK104160908SQ201410403307
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】黄宏文, 刘义飞, 钟彩虹, 李大卫 申请人:中国科学院华南植物园