用于dna末端修复、腺苷酸化、磷酸化的酶组合物的制作方法
【专利说明】用于DNA末端修复、腺昔酸化、磯酸化的酶组合物
[0001 ] 本申请要求2013年9月25日提交的美国专利申请序列号61/882,480和2013年11月 15日提交的美国专利申请序列号61/904,543的优先权，每个专利申请通过引用整体并入本 文。
[0002] 用于高通量 DNA 测序的几种方法（Nature. 437,376-380 (2005) !Science. 309 (2005)728-1732)依赖通用的扩增反应，借此使DM样本随机成片段，然后被处理，使得不同 片段的末端均含有相同的DNA序列。可将具有通用末端的片段用单一对扩增引物在单一反 应中进行扩增。在扩增前将片段文库分离成单分子水平确保被扩增的分子形成离散的群 体。然后可进一步分析运些离散的群体。或者可在乳剂中（Nature.437,376-380(2005); Science.309,5741,1728-1732(2005))或在表面上（Nucleic Acids Research 27，e34 (1999) ;Nucleic Acids Research 28,e87(2000))进行该分离。
[0003] 将通用启动序列添加到可待由聚合酶链式反应(PCR)扩增的祀的末端，可通过本 领域那些技术人员所已知的多种方法来实现。例如，在其5'端含有通用序列，并在其3'端含 有简并序列的通用引物可用于PCR(D0P-PCR，例如，PNAS 93(1996)14676-14679)W扩增随 机来自复杂祀序列或祀序列的复杂混合物的片段。该引物的简并3'部分在随机DNA位置退 火，且可被延伸W生成在其5'端具有该通用序列的祀的拷贝。
[0004] 或者，可将含有通用启动序列的接头连接到所述祀序列的末端。该接头可W是单 链的或双链的。双链接头可能具有突出端或可能具有平端。具有突出端的接头与祀序列上 的突出端互补，该祀序列可能已经由限制性内切核酸酶消化而生成，或由DNA聚合酶或末端 转移酶添加。具有平端的接头用在也是平端的祀，在将所述DNA剪切成片段的过程中形成， 或由如本领域技术人员所已知的末端修复反应所形成。
[0005] 单一接头或两个不同接头可能与祀序列用于连接反应中。如果祀已被操作使得它 的末端是一样的，即，两末端均是平的或两端均具有相同的突出，则单一相容的接头的连接 将生成两端均具有那个接头的模板。然而，如果使用两个相容的接头，接头A和接头B，则形 成连接产物的=种排列：在两端具有接头A的模板、在两端具有接头B的模板W及一端具有 接头A且另一端具有接头B的模板。此最后的产物是，在一些情况下，来自连接反应唯一所需 的产物，并且因此连接反应后的另外的纯化步骤是必要的，W从两端具有相同接头的连接 产物中将其纯化。
[0006] 许多分子生物学研究技术和应用，如为下一代测序(NGS)制备DNA文库需要将合成 的DNA接头添加到受关注的DNA片段的两端。通常通过W下步骤添加合成的接头：（1)通过物 理方式或酶促剪切受关注的DNA样本，（2)将所得的DNA片段进行纯化和憐酸化；（3)将纯化 的DNA片段的3'端由一个核巧酸延伸，优选由dATP延伸，（4)将所得的DNA片段连接到3'端具 有dTTP延伸的接头。祀DNA片段的dA加尾防止它们与其它DNA片段的分子内或分子间的连 接，且从而增加具有预期结构的片段的产率。
[0007] 最近意识到DNA片段的末端修复/纯化和dA加尾反应可在一个管内完成，首先通过 在较低的溫度下进行DNA纯化和憐酸化反应，然后在较高的溫度下对该纯化的DNA片段进行 加尾。可获得W类似的方式工作的商业NGS样本制备试剂盒(化Seq DNA Sample Pr邱Kit, Lucigen；NEBNext UltraDNALibrary Prep Kit,Illumina from NEB；PureGenome HE NGS LibraiT Pr邱 Reagents,EMD Milipore)。然而，只有EMD Millipore公开了用于DNA 3'端 末端延伸的酶:嗜热Nova化q DNA聚合酶。其它两个供应商提供产品使用推荐(在65-72°C下 解育），其引起本领域的技术人员认为嗜热DNA聚合酶还用于dA加尾步骤。表1显示来自 化wEngland Biolabs、EMD MiIipore和Lucigen的DNA末端修复和dA加尾反应的商业试剂和 方案。
[0008] 表1.来自商业供应商试剂盒所使用的单管DNA末端修复和dA加尾条件和试剂。
[0009]
[0010] 肥B和Lucigen产品代表成套试剂，其中DNA末端修复(纯化和憐酸化)和dA加尾反 应所需要的全部酶由用户合并成单一混合物中（酶混合物）。然而，所述反应缓冲液是单独 提供的，且没有与酶预混成随时可用的主混合物。EMD Milipore试剂盒包含在单独小瓶内 所提供的DNA末端修复和dA加尾反应的全部组分。其它供应商正提出双组分的工作流程，其 中受关注的DNA片段首先被纯化和憐酸化，W及然后在第一步骤的酶失活或去除后，添加 dA 加尾酶。
[0011] -般将两种充分表征的聚合酶推荐为在许多克隆方案中所使用的用于dA加尾反 应的优选的酶:3'-5'外切核酸酶活性缺陷的嗜溫Klenow片段突变体，或嗜热化q DNA聚合 酶。运些酶执行非模板指导合成的能力，如在DNA片段的DM3'端添加额外的核巧酸，为本领 域的技术人员所已知。
[0012] 然而，已知两个酶均表现某些偏好，其中最重要的是它们偏爱在其3'端有喀晚(肌 或dC)的DNA片段的3'末端延伸和具有3'-末端嚷岭(dA或dG)的那些DNA片段的仅局部延伸。 结果是，效率低的dA加尾反应后剩余的纯DNA片段可参与分子内连接反应，从而形成在天然 状态下基因组中不存在的杂合DNA分子。如果运样的杂合分子在其3'端含有dA延伸，接头序 列可能被添加到它们，且然后运样的分子可进行测序反应。如果文库制剂含有许多运样的 嵌合分子，则它们随后可能使基因组序列的装配复杂或损害基因组序列的装配。在NGS应用 中嵌合DNA分子可能损害测序的基因组的装配。因此，需要用于NGS文库制备应用的非偏性 DNA片段末端修复/加尾的改进的酶组合物。
[0013] 该公开的酶组合物在长期保存期间是稳定的，且当与在dA加尾步骤中常规使用的 嗜热化q DNA聚合酶和嗜溫Klenow片段ex〇-突变体相比较时，还呈现更好的效率和更少的 偏性。在公开的组合物中用于dA加尾反应的酶是嵌合DNA聚合酶，其没有5'-3'或3'-5'外切 核酸酶活性，由栖热菌属DNA聚合酶和非特异性DNA结合结构域间的融合所生成。适于生成 在本发明中所使用的运样的嵌合DNA聚合酶的DNA结合结构域可能选自由来自Sso家族DNA 结合蛋白的DNA结合结构域组成的组，其包括，但不限于，来自超嗜热古细菌 (hyperthermophilic archaebacteria)硫横石广硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus)的 Sso7d碱性染色体蛋白和来自嗜酸硫化叶菌（S. acidocaldarius)的Sa^d蛋白，在一个实施 方案中，该酶是与非特异性DNA结合结构域融合的布氏栖热菌(Thermus brockianus)DNA聚 合酶(mod-化r，由在化ermo Scientific DyNAmo?产品中所使用的酶作为例证，存放在拉脱 维亚微生物菌株保藏(MSCL，登录号P1397,鉴定参考化SUDESKpRAl'S-DIVOpt))，该酶不具 有5'-3'和3'-5'外切核酸酶活性。在另一个实施方案中，该酶是与非特异性DNA结合结构域 融合的水生栖热菌（Thermus aquaticus)DNA聚合酶(mod-Taq)，存放在MS化(登录号P1396， 鉴别参考邸2566(91^\了651-化31〇119))，该酶没有5'-3'或3'-5'外切核酸酶活性。
[0014] 一个实施方案是在随时可用的主混合物（"Master Mix")中所提供的公开的酶组 合物。主混合物含有mocKTbr或mocKTaq，其与T4DNA聚合酶、Klenow片段、T4多核巧酸激酶和 全部其它组分(包括反应缓冲液和S憐酸核巧)预混，其中dATP浓度是dGTP的浓度的10倍， 并且是dTTP和dCTP的浓度的5倍，其为在一个管内，经两步反应进行DNA纯化、憐酸化和dA加 尾反应所需。运样的不同的酶、缓冲液和=憐酸核巧的混合物在-20°C溫度下在长期保存期 间是稳定的。
[0015] 附图简述
[0016] 图1显示在实施例2中所使用的分别终止于G、C、T和A的双链寡核巧酸。
[0017]图2显示在各种反应缓冲液中，由显示dA加尾效率的Klenow片段ex〇-所处理的图1 的单独双链体寡核巧酸。
[0018]图3显示在各种反应缓冲液中在各种抑下，由显