肝癌相关的基因特异性siRNA、包含所述siRNA的双链寡RNA分子和包含它们的用于预防或 ...的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及肝癌相关的特异性SiRNA和包含所述SiRNA的高效双链寡RNA分子。所 述双链寡RNA分子具有如下结构：其中亲水和疏水化合物通过简单的共价键或接头介导的 共价键与双链寡RNA分子的两末端缀合W有效递送入细胞且可通过双链寡RNA分子的疏水 相互作用在水溶液中转化成纳米颗粒。在双链寡RNA分子中包含的SiRNA可优选为肝癌相关 基因，特别是ZBTB7A、YAP1或CHD1L特异性S iRNA。
[0002] 此外，本发明设及制备双链寡RNA分子的方法，和用于预防和治疗癌症特别是肝癌 的药物组合物，其包含双链寡RNA分子。
【背景技术】
[0003] 抑制基因表达的技术是开发用于治疗疾病治疗剂和证实祀标中的重要工具。在运 些技术中，自从发现了RNA干扰作用(此后称作'RNAi'），已发现RNAi可作用于多种哺乳动物 细胞中的序列特异性mRNA(Silence of the Transcripts = RNA Inte;rference in Medicine，J.Mol.Med. 83:764-773，2005)。当长链双链RNA递送入细胞时，递送的双链RNA转 换成小干扰RNA(此后称为' siRNA'），由称为Dicer的内切酶加工成为21-23个碱基对(bp)， 其中所述SiRNA与RNA-诱导的沉默复合物（RISC)结合，然后引导（反义）链识别并降解祀 mRNA，由此所述SiRNA序列特异性抑制勒!基因的表达（Nucleic-Acid Hierapeutics: BasiC Principles and Recent Applications,Nature Reviews Drug Discovery 1:503-514, 2002)O
[0004] 根据Bedrand等，已发现siRNA在体内和体外与反义寡核巧酸(ASO)相比对相同的 革己基因具有更出色的抑制mRNA表达的效果（Comparison of Antisense Oligonucleotides and siRNAs in Cell Culture and in Vivo,Biochem.Biophys.Res.Commun.,296:1000-1004,2002)。此外，由于SiRNA的作用机制是SiRNA与祀mRNA互补结合W序列特异性控制祀 基因的表达，因此SiRNA所应用的祀标与现有基于抗体的药物或小分子药物相比可显著扩 大（Progress towards in Vivo Use of siRNAs,Molecular Therapy 13(4):664-670, 2006) O
[0005] 尽管SiRNA具有出色的效果和多种用途，为将SiRNA开发为治疗剂，应将所述SiRNA 通过改进SiRNA在体内的稳定性和细胞递送效率有效递送入祀细胞巧arnessing in vivo SiRNA delivery for drug discovery and therapeutic development,Drug Discov.Today 11(1-2):67-73,Jan.2006)。
[0006] 为解决上述问题，已积极实施了对一些核巧酸或SiRNA骨架修饰的技术用于改进 其体内稳定性进而对核酶具有抗性或使用载剂如病毒载体、脂质体、纳米颗粒等的研究。
[0007] 在使用病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等的递送系统中，转染效率高但免疫原性 和致癌性同样很高。另一方面，包括纳米颗粒的非病毒递送系统与病毒递送系统相比具有 低细胞递送效率但具有优势，其中非病毒递送系统在体内可具有高度的稳定性、可祀向特 异性递送、通过将包含其中的RNAi寡核甘酸摄入或内化入细胞或组织改进递送效率等，且 几乎不导致细胞毒性和免疫刺激，因此，目前与病毒递送系统相比已将非病毒递送系统评 估为潜在的递送系统（Nonviral Delivery of Synthetic SiRNA in vivo, J.Cl in.Invest.,117(12):3623-3632,December 3,2007)。
[0008] 在非病毒递送系统中，在使用纳米载剂的方法中，纳米颗粒通过使用多种多聚物 如脂质体、阳离子多聚复合物等形成，然后将iRNA于运些纳米颗粒上支持，即由此将纳米载 剂递送入细胞。在使用纳米载剂的方法中，主要使用多聚纳米颗粒、多聚胶束、脂质复合物 等。其中，脂质复合物由阳离子脂质组成且与细胞中内涵体的阴离子脂质相互作用W将内 涵体去稳定化，由此发挥将iRNA递送入细胞的作用（Proc.化tl. Acad. Sci. 15; 93(21): 11493-8,1996)O
[0009] 此外，已知SiRM在体内的效率可通过将化学化合物等与SiRNA的过客 (passenger)(有义)链末端位点缀合W允许SiRNA具有改进的药物动力学特征(Na化re 11; 432(7014): 173-8,2004)。在运种情况中，SiRNA的稳定性可根据与SiRNA的有义(过客)或反 义（引导)链的末端缀合的化学化合物的性质改变。例如，阳离子化合物存在时，与多聚化合 物如聚乙二醇(PEG)缀合的SiRNA与SiRNA的阴离子憐酸基团相互作用W形成复合物，由此 获得包含改进的SiRNA稳定性的载剂(J.Control Release 129(2): 107-16,2008)。具体地， 由于由多聚复合物组成的胶束具有显著的均匀分布，且与微球、纳米颗粒等相比包含显著 小的尺寸时其具有自发形成的结构，因此其为用作药物递送载剂的另一系统，其在产品的 质量易于管理且再现性易于保障方面存在优势。
[0010] 此外，为改进SiRNA细胞内的递送效率，使用通过将为生物兼容多聚物的亲水化合 物(例如聚乙二醇(PEG))与SiRNA经由简单共价键或接头介导的共价键缀合获得的SiRNA缀 合物开发了用于保障SiRNA的稳定性和实施有效细胞膜通透性的技术（韩国专利登记号 883471)。然而，即使SiRNA是化学修饰的且与聚乙二醇(PEC)缀合，缺点如在体内的低稳定 性和将SiRNA递送入祀器官的难度仍存在。为克服运些缺点，开发了亲水和疏水化合物在其 中与寡核巧酸结合的双链寡RNA分子，特别是双链寡RNA如siRNA。所述分子通过疏水化合物 的疏水相互作用形成自组装的纳米颗粒(其也称作自组装的胶束抑制性RNA(SAMiRNA?)) (参见韩国专利登记号1224828)。SAMiRNA?技术具有优势，其可获得包含与现有递送技术相 比包含显著小尺寸的均质纳米颗粒。
[0011] 同时，四分之一的韩国人死于癌症(死亡的首要原因），且对应诊断方法的建立和 日期采集方法、年龄群体、环境变化等，死于癌症的患者数目每年显著增加。此外，癌症的生 成和由于癌症的死亡在全球也已增加，由此预防、诊断和治疗癌症的方法对于人类来说是 普遍且急需的任务（Bio-Technology(BT)Trends Report,Qirrent Development Trend of New Drug for Major Diseases，Biotechnology Policy 民esearch Center，2007,Edition No .72)D
[0012] 癌症是全球导致最大数目人类死亡的疾病之一，且创新性癌症治疗剂的开发可减 少在治疗癌症时付出的医疗开销并产生高附加值。癌症的疗法分为手术、放射疗法、化疗和 生物疗法。其中，化疗是抑制癌细胞增殖或使用小分子药物杀伤癌细胞的治疗方法。由于在 正常细胞中出现大多数通过抗癌药物表达的毒性，因此抗癌药物W相同程度具有毒性。此 夕h抗癌药物具有抗性，其中所述药物具有抗癌效果但该药物在使用固定周期后丧失抗癌 效果。因此，能够选择性地作用于癌细胞且不生成抗性的抗癌药物的开发刻不容缓 (Current Sl:a1:us of Conquering (Mincer.BioWave 6(19),2004)。近来，已实施新型抗癌 药物的开发，其通过保障癌症的分子遗传信息祀向癌症的分子特征，且已报导祀向特异性 分子祀标的抗癌药物未生成药物抗性。因此，与现有抗癌药物相比包含出色效果并降低副 作用的治疗剂可通过开发祀向仅癌细胞具有的特定分子祀标的基因治疗剂建立。
[0013] 获知基因表达可使用RNA干扰现象特异性并高效抑制后，已实施了对祀向不同基 因的SiRNA作为用于癌症的治疗药物的研究。运些基因的实例可包括致癌基因、抗细胞调亡 分子、端粒酶、生长因子受体基因、信号分子等，所述研究主要朝向抑制癌细胞存活所需基 因或诱导细胞调亡实施（RNA Interference in Cancer,Biomolecular !Engineering 23: 17-34,2006)O
[0014] ZBTB7A(包含锋指和BTB域的7A)是属于已知作为转录抑制子的P0K(P0Z和Krii ppel)的原癌基因。已知ZBTB7A特异性抑制作为肿瘤抑制基因的ARF(INK4a/ARF基因座 (CDKN2A)的可替换阅读框）的转录，且间接地灭活p53(Won-Il Choi等（2009)Prot〇-oncogene FBI-IRepresses Transcription of p21CIPlby Inhibition of Transcription Activation by p53and Spl.T皿 JOURNAL OF BIOLOGICAL C皿MISTRY 284(19):12633-12644)。
[001引换言之，作为ARF-册m2-p53-p21途径的主要控制子，ZBTB7A通过在转录或表达(翻 译)水平抑制上游调节子影响细胞周期阻滞因子p21。因此ZBTB7A加速细胞增殖、显著增加 S 阶段的细胞数目。此外，ZBTB7A在实体肿瘤包括肝癌中异常过表达(FBI-Ipromotes cell proliferation and enhances resistance to chemotherapy of hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo.C曰ncer[2012,118(1):134-146)。
[0016] 已知YAPUYes相关蛋白I)与Src蛋白酪氨酸激酶的細3域结合（Sudol 1(1994) Yes-associated protein(YAP65)is a proline-rich phosphoprotein that binds to the SHSdomain of the Yes proto-oncogene product.Oncogene 9:2145-2152)cYAPl是 潜在的致癌基因，在多种人类癌症中过表达，且是化PPO肿瘤抑制途径中的主要效应子之一 (Pan 0(2010),The hippo signaling pathway in development and cancer.Dev Cell 19:491-505)"YAP1作为TEAD转录因子的共激活因子在转录过程中发挥作用，且增加促进细 胞增殖和抑制细胞调亡的基因的表达(Zhao B，Kim J，Ye X，Lai ZC，Guan KL(2009)Both TEAD-binding and WW domains are required for the growth stimulation and oncogenic transformation activity of yes-associated protein.Cancer Res 69: 1089-98)。已知YAP的下游效应子化卵O肿瘤抑制途径抑制在肝癌形成中与CREB(cAMP响应 元件结合蛋白）相关（Mutual interaction between YAP and CREB promotes tumorigenesis in liver cancer.Hepatology.2013Mar 26)。
[0017] 已知C皿1L(1-样染色质域-解旋酶-DNA-结合蛋白）设及DNA复制、修复和转录所需 的染色质重构和DNA松弛过程（Poly(ADP-;r;Lbose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALCl. Science.2009