示dA加尾效率的化q DNA聚合酶所 处理的图1的单独双链体寡核巧酸。
[0019] 图4显示各种底物浓度下，由显示dA加尾效率的经修饰的布氏栖热菌DNA聚合酶所 处理的图1的单独双链体寡核巧酸。
[0020] 图5示意性示出根据一个实施方案在一种反应混合物中DNA末端修复和3'末端延 伸。
[0021] 图6显示使用不同聚合酶在一个反应混合物中DNA末端修复和3'末端延伸。
[0022] 图7显示根据一个实施方案所描述的组合物的稳定性。
[0023] 在一个实施方案中，公开的组合物包含W下组分：
[0024] 酶；
[0025] IuAU T4多核巧酸激酶
[0026] 0.3化AU T4DNA聚合酶
[0027] 0.1 化AU Klenow片段
[0028] 0.化AU mod-Tbr DNA聚合酶
[0029] 反应辅因子和核巧酸：
[0030] 20mM MgCb
[0031] 2mM dATP
[0032] 〇.4mM dCTP
[0033] 〇.4mM dTTP
[0034] 〇.2mM dGTP [00巧]2mM ATP
[0036] 可使用IOOmM-IOSmM Tris-HCKpH 8.3)和单价金属盐酸盐(例如NaCl、KCl、LiCl) W20mM至50mM的浓度范围配制组合物离子强度和抑值。在一个实施方案中，该组合物含有 W下稳定剂和冷冻保护剂：20mM X-100、12%(v/v)甘油、0.07%NP40、 0.07%吐溫20和0.024111]\1邸1八。
[0037] -个实施方案是用于在单个容器(如化pendorf型管、96孔板或任何其它用于建立 酶促反应的器皿）内进行DNA末端修复和末端核巧酸添加的方法。在一个实施方案中，DNA末 端修复包括生成平端和憐酸化的DNA片段。在一个实施方案中，在单个容器内将DNA片段与 所述的组合物混合，W及在单个容器内进行该DNA片段的DNA末端修复和核巧酸加尾。在一 个实施方案中，该末端核巧酸是腺巧，其被添加到该DNA片段的3'末端，并被称为dA加尾。在 一个实施方案中，使该单个容器的内容物经历第一个反应条件W促进DNA末端修复反应，且 然后使该容器的内容物经历第二反应条件W促进dA加尾反应和使DNA末端修复反应失活， 其中该DNA末端修复反应包括使该DNA片段纯化和憐酸化，且该dA加尾反应包括通过将单一 dA添加到该末端被修复的DNA片段的3'端上使该DNA片段腺巧酸化。在一个实施方案中，所 述第一反应条件包括使所述单个容器的内容物经历18°C至22°C (包括端值)的溫度持续5至 10分钟(包括端值)的时间段，W及所述第二反应条件包括使所述容器内容物经历72°C至75 °C (包括端值）的溫度持续10至20分钟(包括端值）的时间段。在一个实施方案中，所述第一 反应条件包括使所述容器内容物经历约20°C的溫度持续约5分钟，W及所述第二反应条件 包括使所述容器内容物经历约72 °C的溫度持续约10分钟。在一个实施方案中，dA加尾的DNA 片段的产率超过75%。
[0038] 在一个实施方案中，所述方法进一步包括在DNA末端修复之前生成DNA片段。DNA片 段可通过物理DNA剪切方法如超声雾化和流体动力剪切，或通过使用面asel或其它内切核 酸酶的酶促消化来生成。在一个实施方案中，所述DNA样本包括基因组DNA。在一个实施方案 中，所述方法可进一步包括通过将合成DNA接头接合到核巧酸加尾的DNA片段的一端或两端 来生成DNA文库。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述末端修复和dA加尾的DNA 片段连接到在其3 '端有dT延伸的合成DNA接头。
[0039] 一个实施方案是一种含有用于执行单管DNA纯化和dA加尾的公开的方法的公开的 组合物和使用说明书的试剂盒。在一个实施方案中，所公开的组合物包含0.加 AU-1.加 AU T4多核巧酸激酶、0.2u/山-0.5u/山T4DNA聚合酶、0.1 u/山-0.2uAU Klenow片段和0.1 uAi l-0.5u/iU mod-Tbr DNA 聚合酶；反应辅因子和核巧酸：20mM MgCl2〇.4mM-3mM dATP、 0.2mM-0.6mM dCTP、0.2mM-0.6mM dTTP、0.1mM-0.4mM dGTP、1.5mM-2.5mMATP:离子强度和 pH调节剂：IOOmM-IOSmM IYis-HCl (pH 8.0-8.8);单价金属盐酸盐，例如，化Cl、KC1、LiCl (20mM至50mM);和稳定剂和冷冻保护剂: 15mM-30mM DTT; 0.1 % -0.4 % Tr i ton X-IOO; 10 % -20%(v/v)甘油；0.05%-0.15%NP 40;0.05%-0.15%吐溫20;和0.02mM-0.1mM EDTA。
[0040] 在一个实施方案中，所公开的组合物包含酶：IuAil T4多核巧酸激酶、0.3化AU T4DNA聚合酶、0.1化AU Klenow片段和0.化AU mod-Tbr DNA聚合酶；反应辅因子和核巧 酸：20mM MgCl22mM dATP、0.4mM dCTP、0.4mM dTTP、0.2mM dGTP、2mM ATP;离子强度和pH调 节剂：IOOmM-IOSmM Tris-HCUpH 8.3);单价金属盐酸盐例如化 Cl、KCl、LiCl(20mM 至 50mM);和稳定剂和冷冻保护剂：20mM DTT; 0.2 %IYiton X-IOO ; 12 % (v/v)甘油；0.07 % 邮40;0.07%吐溫20;和0.024111]\1邸1八。
[0041] 现在参考W下实施例进一步详细描述本发明，运些实施例仅作为说明。
[0042] 实施例1
[0043] 证明不同的酶要求不同的缓冲液
[0044] 本领域已知每种酶具有不同的最佳保存和反应条件。酶保存条件往往不同于在表 2所显示的推荐的反应条件，表2显示由W下商业供应商所销售的DNA纯化、憐酸化和dA加尾 的酶的保存和反应缓冲液的组分：Thermo Fisher Scientific,化W England Biolabs和 Life Technologies。
[0045] 表2.用于DNA片段的纯化、憐酸化和dA加尾的酶的保存缓冲液(SB)和反应缓冲液 (RB)
[0046]
[0047]
[004引
[0049] 为获得本发明的组合物，全部W上所指示的酶T4DNA聚合酶、Klenow片段、T4DNA多 核巧酸激酶和具有末端加尾活性的经修饰的嗜热聚合酶，如经修饰的布氏栖热菌或水生栖 热菌DNA聚合酶，必须被预混成能够W单一步骤并且在一个容器内使DNA片段有效纯化、憐 酸化和dA加尾的稳定的共混物。重要的是要注意运远不是微不足道的，并且甚至本领域那 些技术人员也需要试验大量的保存和反应条件来获得当保存时将会稳定，W及当在酶促反 应中使用时有效的混合物，且将不能保证来确定最佳保存和反应条件。在运样的混合物中 的酶可具有不同的最佳要求，运使它们在单一共混物中不相容。此外，在制备随时可用的 1X-2X酶混合物时，由于冷冻保护剂对酶促反应的负面影响，使用高浓度的冷冻保护剂如甘 油往往是不恰当的，因为它们影响物理和化学环境从而导致反应条件改变。此外，高浓度冷 冻保护剂可能对酶活性具有抑制作用。结果是，只可使用低浓度冷冻保护剂，其往往不足W 防止酶共混物的冻结。因此，在多个冻融循环中有非常高的酶活性损失风险。一种酶所需的 添加剂可能对该组分共混物的另一种酶的保存和/或催化活性任一项是有害的。运同样适 用于盐，W及其浓度，其用于缓冲系统，W及用于在随时可用的混合物的pH值。一般来说，随 时可用的混合物的稳定性由单价盐耐受性和存在足够的离子强度来确定。单价盐可能是其 中金属，例如，Na、K或Li在溶液中具有净r电荷的任一种盐。
[0050] 在制备用于DNA片段末端修复/dA加尾的稳定的酶主混合物时，与在本实施例中W 前所公开的信息相反，所公开的随时可用的组合物(包含酶T4DNA聚合酶、Kl enow片段、W多 核巧酸激酶和mod-化r或mod-化q DNA聚合酶和全部其它W前所描述的必需的反应组分)能 够实现有效的DNA片段的单管纯化、憐酸化和dA加尾，其导致dATP延伸的DNA片段的产率超 过75%。所公开的组合物提供一种主混合物，当与其它商业NGS样本制备试剂盒比较时，其 减少用于制备DNA片段(如用于NGS文库制备)所需要的移液步骤数。减少移液步骤简化了 NGS文库制备工作流程，因为它设及较少的操作和动手时间，将误差降至最低，W及因此提 供整个样本组的更一致的结果。所公开的组合物混合物在短得多的反应时间内修饰DNA片 段，因为它在20°C下在5分钟内使DNA片段纯化和憐酸化，并通过在72°C下在10