用于处理细胞培养物的方法和系统的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关文献的交叉引用
[0002] 本申请要求保护2013年9月16日提交的美国临时专利申请号61/878,502的优先 权，其全部内容在本文通过提述并入。
技术领域
[0003] 本发明设及处理细胞培养物的方法和生物技术，且更具体地，设及连续处理灌注 生物反应器中细胞培养物的方法。
[0004] 背景
[0005] 哺乳动物细胞经常用于产生治疗性蛋白。在一些处理方法中，哺乳动物培养在灌 注生物反应器中，将一定体积的包括重组蛋白的细胞培养物从生物反应器去除，并添加新 的培养基W替换所述体积。在运种灌注培养方法中，经常过滤去除细胞培养物W保持哺乳 动物细胞在生物反应器中用于进一步重组蛋白的生产，同时回收包括重组蛋白的培养基 (有时称为"耗竭的培养基"）。
[0006] 用于从灌注生物反应器过滤细胞培养物的常规方法和装置具有数项劣势。举例来 说，改变切向流过滤(ATF)的封闭系统导致细胞培养物在控制生长条件的生物反应器外花 费一段较长的时间（长外部停留时间），且无逆向流动的传统的单向切向流过滤(TFF)引起 过滤器结垢。由此，常规灌注生物反应器方法经常设及在控制生长条件的生物反应器外花 费一段较长时间的细胞培养物，导致活细胞密度、百分比活力W及培养比生产率和体积生 产率的减少。此外，之前的方法经常导致系统过滤器的不完全冲洗，使得过滤器结垢。
[0007] 发明概述
[000引申请人发现了开放回路过滤系统(与常规单向开放回路或双向闭合回路过滤系统 相对，其提供穿过交叉流过滤器的表面的可逆切向流体流动)提供了增加的活细胞密度、增 加的百分比活细胞、增加的比生产率和/或体积生产率，增加的比葡萄糖消耗和减少的过滤 器结垢。
[0009]本文给出的开放回路过滤系统提供了用于产生和收获重组蛋白的最佳条件，例 如，如与其他单向开放回路过滤系统(例如单向TFF系统)或双向闭合回路过滤系统（闭合回 路ATF?系统)相比，减少细胞培养物外部体积(胆液器外）、增加交换百分数(例如第一导管、 TFF单元和第二导管内）、减少细胞培养物的外部停留时间（胆液器外）、减少细胞培养物过 滤过程中的剪切应力、改善细胞培养物中的细胞活力、提高细胞培养物中的活细胞密度和/ 或减少过滤器结垢（由于过滤器的更佳冲洗）中的一种或多种。相应地，本文提供了开放回 路过滤系统，其包括胆液器(例如生物反应器）、具有第一和第二入口的切向流过滤(TFF)单 元，流体连通所述胆液器和所述TFF单元第一入口间的第一导管，和流体连通所述胆液器和 所述TFF单元第二入口间的第二导管，和至少一个置于系统中的累，进而驱动至少一个累使 流体可逆地从所述胆液器流通所述系统、流通所述第一导管、TFF单元、第二导管，并流回至 储液器。还提供了处理细胞培养物的方法，其包括(a)提供开放回路过滤系统(例如任何本 文所述的开放回路过滤系统），（b)使细胞培养物从胆液器W第一流动方向持续第一时间段 流通TFF单元，（C)逆转所述第一流动方向并使细胞培养物W第二流动方向持续第二时间段 流通TFF单元，（d)逆转第二流动方向并使培养物W第一流动方向持续第S时间段流通TFF 单元，（e)重复步骤(c)-(d)至少至少两次;并(f)收集滤液。
[0010] 本文提供了处理细胞培养物的方法。运些方法包括下列步骤:a)提供开放回路过 滤系统，其包括含有细胞培养物的胆液器、具有第一和第二入口的切向流过滤(TFF)单元， 流体连通所述胆液器和所述TFF单元第一入口间的第一导管，和流体连通所述胆液器和所 述TFF单元第二入口间的第二导管，和至少一个置于所述系统用于使流体流通所述系统的 累，其中配置所述系统进而使流体能够经由所述至少一个累可逆地从或至胆液器流通所述 系统，并流通第一和第二导管和TFF单元，并可从TFF单元收集滤液；（b)使细胞培养物从所 述胆液器W第一流动方向持续第一时间段流通TFF单元，（C)逆转所述第一流动方向并使细 胞培养物W第二流动方向持续第二时间段流通TFF单元；（d)逆转所述第二流动方向并使所 述培养物W第一流动方向持续第S时间段流通TFF单元；（e)重复步骤(c)-(d)至少两次;并 (f)收集所述滤液。在一些实例中，所述胆液器是生物反应器或冷藏储存罐。在一些实例中， 第一和第二导管之一或两者包括生物相容性管。TFF单元可包括单交叉流过滤器(例如管状 交叉流过滤器)或可包括两个或多个交叉流过滤器。
[0011] 在一些实例中，所述系统包括置于所述第一导管、所述第二导管，或两者中的一个 或多个额外的TFF单元。在一些实例中，所述交叉流过滤器具有约0.2微米的平均孔径。
[0012] 在一些实例中，所述至少一个累置于所述第一导管或所述第二导管或两者中。在 其他实例中，所述至少一个累置于任何两个TFF单元间的系统中。在一些实施方案中，所述 至少一个累置于所述胆液器中并接近所述第一或所述第二流体导管。在本文所述的全部方 法的一些实施方案中，所述至少一个累是低端流累化TP)(例如蠕动累）。在一些实例中，所 述系统包括第一和第二LTP，其中所述第一 LTPW第一方向使细胞培养物流动且所述第二 LTPW第二方向使细胞培养物流动。在一些实施方案中，所述系统包括单LTP，其中所述单 LTP在第一和第=时间段使所述细胞培养物W第一方向流动且在第二时间段使所述细胞培 养物W第二方向流动。
[0013] 在本文所述的任何方法中，所述第一、第二和第=时间段为约30秒至约15分钟。在 一些实施方案中，所述细胞培养物W约0.化/分钟至约80L/分钟（例如约3.化/分钟至约 60L/分钟）的速率在(a)、(b)和(C)的一步或多步中流动。
[0014] 在一些实施方案中，（b)和(C)的单次重复导致多于50%的交换百分数。在一些实 例中，所述滤液不包含哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含分泌重组蛋 白且所述滤液包含分泌重组蛋白。在一些实施方案中，所述分泌重组蛋白是抗体或其抗原 结合片段、生长因子、细胞因子或酶，或其组合。一些实施方案进一步包括从所述滤液分离 所述分泌重组蛋白的步骤。举例来说，分离可W使用包括通过至少一个多重柱层析系统 (MCCS)的分离的整合和连续步骤实施。一些实施方案进一步包括通过将分离的重组蛋白与 药物上可接受的赋形剂或缓冲剂混合配制治疗性药物物质的步骤。在一些实施方案中，所 述细胞培养物或滤液或两者是无菌的。在一些实例中，所述方法连续实施约14天至约80天 的时间段。
[0015] 还提供了开放回路过滤系统，其包括胆液器、具有第一和第二入口的切向流过滤 (TFF)单元，流体连通所述胆液器和所述TFF单元第一入口间的第一导管，和流体连通所述 胆液器和所述TFF单元第二入口间的第二导管，和至少一个置于系统中的累，其中驱动所述 至少一个累使流体可逆地从所述胆液器流通所述系统、流通所述第一导管、所述TFF单元、 所述第二导管，并流回所述胆液器。在一些实例中，所述胆液器是生物反应器或冷藏储存 罐。在一些实施方案中，所述第一和第二导管之一或两者包括生物相容性管。在一些实施方 案中，所述TFF单元包括单交叉流过滤器(例如管状交叉流过滤器）。在一些实施方案中，所 述TFF单元包括两个或多个交叉流过滤器。在一些实例中，所述系统包括置于所述第一导 管、所述第二导管，或两者中的一个或多个额外的TFF单元。在一些系统中，所述交叉流过滤 器具有约0.2微米的平均孔径。
[0016] 在本文所述的系统的一些实施方案中，所述至少一个累置于所述第一导管或所述 第二导管或两者中。在其他实施方案中，所述至少一个累置于任何两个TFF单元间的系统 中。在其他实例中，所述至少一个累置于所述胆液器中并接近所述第一或所述第二流体导 管。在本文所述的任何系统中，所述至少一个累是低端流累化TP)(例如蠕动累）。在一些实 施方案中，所述系统包括第一和第二LTP，其中所述第一LTP适于使细胞培养物W第一流动 方向流动且所述第二LTP适于逆转所述第一流动方向并使细胞培养物W第二流动方向流 动。在其他实施方案中，所述系统包括适于可逆地使细胞培养物W第一和第二流动方向流 动的单LTP。在一些实施方案中，所述蠕动累具有约20mL至约250mL的累头体积。
[0017] 本文所述系统的一些实施方案进一步包括滤液储存罐和流体连通所述TFF单元和 所述滤液储存罐的滤液导管。本文所述系统的一些实施方案进一步包括生物制造系统，所 述生物制造系统包括至少一个多重柱层析系统(MCCS)和入口和出口和流体连通TFF单元和 所述生物制造系统入口间的滤液导管，其中配置所述装置进而滤液流入所述生物制造系统 的入口，通过所述至少一个MCCS并通过所述生物制造系统的出口排出所述装置。在本文所 述的任何系统中，所述TFF单元置于外罩中。
[0018] 如本文使用的名词前的词语"一个"或"多个"表示一个或多个特定的名词。举例来 说，短语"一个哺乳动物细胞"表示"一个或多个哺乳动物细胞"，且短语"多个微载体"意为 "一个或多个微载体"。
[0019] 术语"哺乳动物细臘'意为任何来自或源自任何哺乳动物(例如人、仓鼠、小鼠、绿 猴、大鼠、猪、牛或兔)的细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞可W是例如永生细胞、 分化细胞或未分化的细胞。
[0020] 术语"细胞培养物"意为悬浮于液体培养基（例如本文所述的任何液体培养基）中 的多个哺乳动物细胞（例如任何本文所述的哺乳动物细胞）。细胞培养物可具有多于约 0.1 xlO6细胞/mL(例如多于约IxlO6细胞/mU多于约SxlO6细胞/mL、多于约IOxlO 6细胞/mL、 多于约15xl06细胞/mL、多于约20xl06细胞/mL、多于约25xl0 6细胞/mU多于约30xl06细胞/ mU多于约35xl06细胞/mL、多于约40xl0 6细胞/mL、多于约45xl06细胞/mL、多于约SOxlO6细 胞/mL、多于约55xl0 6细胞/mL、多于约SOxlO6细胞/mL、多于约65xl06细胞/mL、多于约70xl0 6 细胞/mU多于约75xl06细胞/mU多于约SOxlO6细胞/mU多于约85xl0 6细胞/mU多于约 90xl06细胞/mU多于约95xl06细胞/mL或多于IOOxlO 6细胞/mU的细胞密度。在一些实例中， 细胞培养物中存在的哺乳动物细胞附着至微载体(例如任何本文所述的或本领域已知的微 载体)。
[0021] 术语"生物反应器"为本领域已知且意为在允许哺乳动物细胞在液体培养基中维 持或生长的一组受控的物理条件下溫育细胞培养物的容器。举例来说，所述生物反应器可 在允许哺乳动物细胞在细胞培养物中产生并分泌重组蛋白的条件下溫育细胞培养物。举例 来说，生物反应器通常包括化和化喷射器、热护套、一个或多个流体端口和揽拌系统。本文描 述了生物反应器的非限制性实例。生物反应器的其他实例为本领域已知。
[0022] 术语"开放回路过滤系统"意为胆液器(例如生物反应器)和在胆液器初始并结束 的连续闭合流体回路，并包括TFF单元，通过该TFF单元在闭合流体回路中的流体(例如细胞 培养物)可传至和来自胆液器（W第一或第二流动方向），通过TFF单元并流回胆液器。开放 回路过滤系统还包括至少一个适于将流体(例如细胞培养物)累至胆液器和/或从胆液器累 出并通过TFF单元并流回至所述胆液器的累。
[0023] 术语"切向流过滤单元"或"TFF单元"为本领域已知且意为包括至少一个外罩（如 圆筒)和至少一个置于外罩中的交叉流过滤器进而大部分的过滤表面处于与通过所述单元 的流体(例如细胞培养物)流平行位置的装置。TFF单元为本领域已知且可商业获得。示例性 的商业可获得的TFF单元包括 Minimate?TFF胶囊(Pal ICorporat ion)、Vivafiow 饭 50 和200 系统（Sartorius)、BioCap25、E0170、E0340和E1020胶囊（3M)和ATF4过滤器 (Ref ineTechnology)。外罩可包括第一入口 /出口和第二入口 /出口，其处于例如允许流体 通过第一入口/出口、穿过至少一个交叉流过滤器并通过第二入口/出口的位置。在一些实 例中，开放回路过滤系统可包括多重TFF单元，例如串联和/或平行连接。举例来说，包括两 个或多个TFF单元的系统可包括流体性连接系统中邻近的TFF单元对的流体导管。在其他实 例中，系统可包括两组或多组由流体导管流体性连接的两个或多个TFF单元。任何本文所述 或本领域已知的TFF单元能够接受第一流动方向和第二流动方向的流体。
[0024] 术语"交叉流过滤器"为本领域已知且意为经设计进而其可位于TFF单元中进而大 部分的过滤器表面与流体(例如细胞培养物）的流动（例如第一和第二流动方向）平行的过 滤器。举例来说，交叉流过滤器可具有任何允许切向流过滤的形状，例如管状或矩形形状。 特别有用的交叉流过滤器经设计使得当流体W第一和第二方向流过交叉流过滤器的表面 时，导致流体(例如细胞培养物）中具有少量的流体端流或剪切应力。交叉流过滤器为商业 可获得，例如来自 Sa;rto;r ius、MembraF*ure、Mi 11 ipore 和 F*al 1 Co;rporat ion。
[0025] 术语"低端流累"或"LTP"为本领域已知且意为可在系统内W单方向（例如第一或 第二流动方向）移动流体(例如细胞培养物)或使流体在系统内W两个方向（第一和第二流 动方向）可逆流动但不在流体（例如细胞培养物）中诱导大量的剪切应力或流体端流的装 置。当将LTP用于使流体(例如细胞培养物）W交替的第一和第二流动方向流动时，第二流动 方向与第一流动方向大致相反。LTP的一个实例是蠕动累。LTP的其他实例为本领域已知。
[0026] 术语"逆转流动"或"逆转流动方向"为本领域的技术人员已知。举例来说，本领域 的技术人员将理解的是逆转流体的流动意为改变流体的整体流动方向W大体上使整体流 动方向相反(例如本文所述的任何方法或系统中的细胞培养物的流动方向）。
[0027] 术语"交换百分数"意为使流体W第一方向持续第一时间段流通胆液器外的开放 回路过滤系统组件(例如通过第一导管、至少一个TFF单元和第二导管)并使流体W第二方 向持续第二时间段流动后返回至胆液器的流体(例如细胞培养物)百分比。
[002引术语"基本上没有/不含"意为至少或约90%没有(例如至少或约95%、96%、97%、 98%，或至少或约99%没有或约100%没有)特定物质（例如哺乳动物细胞或宿主哺乳动物 细胞蛋白或核酸）的组合物(例如液体或固体）。举例来说，使用本文所述的方法生成的滤液 可基本上没有哺乳动物细胞或微载体。在另一实例中，使用任何本文所述的方法分离的重 组蛋白可基本上没有宿主哺乳动物细胞蛋白、核酸和/或污染病毒。
[0029] 术语"培养"或"细胞培养"意为在液体培养基中在一组受控的物理条件下哺乳动 物细胞的维持和生长。
[0030] 术语"液体培养基"意为包括足够营养W允许哺乳动物细胞在体外培养中生长的 流体。举例来说，液体培养基可包括一种或多种的:氨基酸(例如20种氨基酸）、嚷岭(例如次 黄嚷岭）、喀晚(例如胸腺喀晚）、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸、生物素、巧、烟酷胺、化唉醇、核黄 素、胸腺喀晚、氯钻胺素、丙酬酸、硫辛酸、儀、葡萄糖、钢、钟、铁、铜、锋、砸和其它必需的痕 量金属，和碳酸氨钢。液体培养基可包括来自哺乳动物的血清。在一些实例中，液体培养基 不包括来自哺乳动物的血清或另一提取物(限定的液体培养基）。液体培养基可包括痕量金 属、哺乳动物生长激素和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的非限制性实例描述于本文且 其他实例为本领域已知且为商业可获得。
[0031] 术语"微载体"意为具有20WI1至约1000 wii大小、包括允许或促进哺乳动物细胞(例 如任何本文所述或本领域已知的哺乳动物细胞)附着的表面的颗粒(例如有机聚合物）。微 载体可包括一个或多个孔(例如具有约IOwii至约IOOwii的平均直径的孔）。微载体的非限制 性实例描述于本文。微载体的其他实例为本领域已知。微载体可包括例如聚合物(例如纤维 素、聚乙二醇或聚(乳酸-共-乙醇酸））。
[0032] 术语"没有源自动物的组分的液体培养基"意为不包括任何源自动物的组分(例如 蛋白或血清)的液体培养基。
[0033] 术语"没有血清的液体培养基"意为不包括动物血清的液体培养基。
[0034] 术语"包括血清的液体培养基"意为包括动物血清的液体培养基。
[0035] 术语"化学上限定的液体培养基"意为其中基本上全部化学组分为已知的液体培 养基。举例来说，化学上限定的液体培养基不包括胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋 白，由于运些制剂通常包括白蛋白和脂质的复杂混合物。
[0036] 术语"没有蛋白的液体培养基"意为不包括任何蛋白的液体培养基(例如任何可检 测的蛋白）。
[0037] 术语"免疫球蛋白"意为包括免疫球蛋白（例如可变结构域序列、框架序列或恒定 结构域序列）的至少15个氨基酸(例如至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)的氨 基酸序列的多肤。免疫球蛋白可举例来说包括轻链免疫球蛋白的至少15个氨基酸和/或重 链免疫球蛋白的至少15个氨基酸。免疫球蛋白可W是分离的抗体(例如IgG、I姐、I曲、I gA或 IgM)。免疫球蛋白可W是IgG的亚类(例如IgGU IgG2、IgGS或IgG4)。免疫球蛋白可W是抗体 片段，例如化b片段、F(ab〇2片段或SCFv片段。免疫球蛋白还可W是双特异性抗体或S特异 性抗体或二聚体、S聚体或多聚体抗体，或双抗体、Affibo#?或Nanobody?。免疫球蛋 白还可W是工程化的包括至少一个免疫球蛋白结构域的蛋白（例如融合蛋白）。免疫球蛋白 的非限制性实例描述于本文且其他免疫球蛋白的实例为本领域已知。
[0038] 术语"蛋白片段"或"多肤片段"意为多肤序列的一部分，其长度为至少或约4个氨 基酸，例如至少或约5个氨基酸、至少或约6个氨基酸、至少或约7个氨基酸、至少或约8个氨 基酸、至少或约9个氨基酸、至少或约10个氨基酸、至少或约11个氨基酸、至少或约12个氨基 酸、至少或约13个氨基酸、至少或约14个氨基酸、至少或约15个氨基酸、至少或约16个氨基 酸、至少或约17个氨基酸、至少或约18个氨基酸、至少或约19个氨基酸或至少或约20个氨基 酸或长度多于20个氨基酸。重组蛋白片段可使用本文所述的任何方法产生。
[0039] 术语"工程化蛋白"意为并非天然由在生物体(例如哺乳动物）内存在的内源核酸 编码的多肤。工程化蛋白的实例包括酶(例如具有一个或多个导致工程化酶的稳定性和/或 催化活性增加的氨基酸取代、缺失、插入或添加）、融合蛋白、抗体(例如二价抗体、=价抗体 或双抗体)和包括至少一个重组支架序列的抗原结合蛋白。
[0040] 术语"分离"或"分离的"在一些背景中意为从滤液(例如使用当前所述的方法生成 的滤液）中存在的一种或多种其他组分(举例来说一种或多种DNA、RNA和/或其他存在于滤 液中的蛋白组分）至少部分纯化或纯化（例如按重量至少或约5%，例如至少或约10%、 15%'20%'25%'30%'40%'45%'50%'55%'60%'65%'70%'75%'80%'85%'90%或 至少或约95%纯的）重组蛋白。用于从滤液分离蛋白的非限制性方法描述于本文且其他为 本领域已知。
[0041] 术语"分泌的蛋白"或"分泌重组蛋白"意为当在哺乳动物细胞中翻译时原始包括 至少一个分泌信号序列的，且在哺乳动物细胞中至少部分通过酶裂解分泌信号序列至少部 分释放入胞外空间（例如液体培养基)的蛋白或重组蛋白。
[0042] 短语"梯度灌注"为本领域已知且指代在培养期过程中（例如W每日为基础的培养 基再补给速率)在渐进的时间段中（例如约24-小时的时段，约1分钟至约24小时的时段或多 于24小时的时段）去除或添加至初始培养体积的培养基体积的渐进改变（例如增加或减 少）。每天去除或替换的培养基百分数可取决于培养的特定细胞、最初的接种密度和在特定 时间的细胞密度改变。
[0043] 如本文使用的"比生产率"或"SPR"指每哺乳动物细胞每日产生的重组蛋白的质量 或酶活性。重组抗体的SH?经常W质量/细胞/天测量。重组酶的SH?经常W单位/细胞/天或 (单位/质量)/细胞/天测量。
[0044] 如本文使用的"体积生产率"或"VPR"指每体积的培养物(例如每L的生物反应器、 容器或管体积)每天产生的重组蛋白的质量或酶活性。重组抗体的vra经常W质量/L/天测 量。重组酶的VPR经常W单位/L/天或质量/L/天测量。
[0045] 除非另外限定，本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技 术人员所理解相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料;也可使用其他适当的本 领域已知的方法和材料。材料、方法和实例仅为阐述性的且并非意在限制。本文提及的全部 公开、专利申请、专利、序