一种用于100个以内细胞的蛋白质组自动化分析系统及方法
【专利摘要】本发明属于生物分析与检测【技术领域】，具体为一种用于100个以内细胞的蛋白质组自动化分析系统及方法。本发明以一个可切换的十通阀为中心，与注射泵、多元梯度泵、质谱仪、上样泵、毛细管道连接组成系统切换流路。使用时将细胞直接注入切换系统的微反应通道中，经过酶解将肽段切换富集在捕集柱上，除盐纯化，再经切换，进行液相色谱-质谱分析。由于使用了在线系统，细胞的引入、酶解、捕集、除盐等步骤可自动完成，大大降低了微量样品的损失。实验结果表明该自动化分析系统对微量细胞的样品能够鉴定到较多种类的蛋白。本发明简单实用，灵敏度高，具有推广应用前景。
【专利说明】一种用于100个以内细胞的蛋白质组自动化分析系统及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分析与检测【技术领域】，具体涉及一种酶解微量细胞用于蛋白质组自动化分析系统及方法。
【背景技术】
[0002]在最近几年，蛋白质组学有了长足的发展，其重要性也日益为人所了解。在通常情况下，待分析样品(不管是细胞，还是组织或者体液)的分量都是充足的，但是在一些特殊情况下，微量细胞的分析变得十分重要。第一，生物体有一些特定的细胞亚群，比方说，Mann等就分析了单个胰岛的蛋白质组，仅包含2000到4000个细胞，结果显示，单个胰岛的蛋白组，不论是在蛋白种类方面，还是在蛋白含量方面，都与周围的胰腺组织有显著不同。第二，在临床环境中，收集某类细胞并非易事，比方说利用激光捕获微切割术分离肿瘤组织中的变异细胞就是一个耗时的工作，要收集1000个细胞可能需要两个小时。第三，循环肿瘤细胞(CTC)具有重要的生物学意义，但是血液中的含量很低，据一项调查发现，从1mL癌症血清中收集到500个循环肿瘤细胞的概率仅为62%。
[0003]此外，单细胞分析一直是一个研宄热点，因为相比于多细胞分析，单细胞分析对于揭示生命活动的机理能够提供更多的信息。Dovichi等使用各种不同的CE-LIF模式来表征单细胞的蛋白质组。然而利用质谱来分析单细胞将是一个更吸引人的目标，因为质谱能够揭示蛋白的种类信息。为实现这个目标，必须先满足两个条件。第一是质谱有极高的灵敏度，事实上，最新的质谱仪器已经可以检测单细胞水平的蛋白分子；第二是在把细胞转换成质谱可鉴定的肽段时必须减少样品损失。常规的样品处理流程包括细胞破膜、蛋白提取、蛋白纯化、巯基的还原烷基化、酶解等步骤，其中还往往涉及到缓冲盐的置换、ziptip除盐等操作步骤。其系统复杂，操作麻烦。
[0004]为此，我们简化这些步骤，设计了自动化分析系统，在一个微小的密闭体积内使用直接酶解法完成对完整细胞样品的处理，尽可能降低了样品的损失，完成了对微量细胞的蛋白质组高灵敏度分析。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种结构简单、操作方便的用于100个以内细胞的蛋白质组自动化分析系统及方法。
[0006]本发明提供的蛋白质组自动化分析系统，以一个可切换的十通阀为中心，与注射泵、多元梯度泵、质谱仪、上样泵、毛细管道连接组成；十通阀的内部通道直径为50-250微米；其中，十通阀的第一位置与注射针及注射泵连接，第二位置与毛细管连接作为完整细胞与酶混合溶液的进液口，第三位置和第十位置之间连接体积为1-5微升的毛细管，作为细胞的酶解样品环；第位置四和第位置七之间连接肽段的捕集柱；第位置五连接液相色谱的多元梯度泵；第位置六连接质谱仪；第位置八连接废液出口 ；第位置九连接上样泵。
[0007]使用上述蛋白质组自动化分析系统，可进行蛋白质组的自动化分析，即将完整细胞与酶的混合溶液注入连接在十通阀上的样品环内，经过特定时间(约两小时)的“一步法”酶解，随后通过阀的切换，将酶解后的混合物通过泵富集到捕集柱上，对肽段进行富集纯化后，再次切换阀，将捕集柱与液相色谱纳流泵连接进行液相色谱分离和质谱系统检测，具体步骤如下:
(1)把细胞培养收集之后，用PBS稀释成10-100个/^L的浓度，加入碳酸氢铵、盐酸胍和胰蛋白酶后配制成细胞酶解液，精确计数，并且根据计数结果确定进样体积；
(2)使用注射泵将细胞酶解液吸入十通阀上的样品环内，切换十通阀的位置，使样品环两端封闭，置于柱温箱或水浴中，37°C?50°C的温度下保持1-4小时；期间对样品环超声振荡若干次，完成酶解；
(3)切换十通阀的位置，使样品环一端与上样泵相连，一端与捕集柱相连，通过上样泵的推动，将肽段富集在捕集柱上，并进行除盐纯化；
(4)切换十通阀的位置，利用多元梯度泵的梯度将肽段逐步洗脱，在毛细管反相色谱柱上分离，并且使用质谱仪完成对肽段的检测。
[0008]本发明中，所述的肽段捕集柱的结构为:在5-20cm长、20-75微米内径的毛细管中采用溶胶-凝胶法制作双柱塞，双柱塞中间填入3-10毫米长的C8或C18填料。
[0009]本发明中，所述细胞酶解液配方为:在分散于PBS缓冲液中的细胞液内加入20-100mM的碳酸氢铵，50-500mM的盐酸胍，l_10ng/^L的胰蛋白酶。
[0010]本发明采用十通阀构建系统切换流路，将细胞直接注入切换系统的微反应通道中，经过酶解将肽段切换富集在捕集柱上，除盐纯化，再经切换，进行液相色谱-质谱分析。由于使用了在线系统，细胞的引入、酶解、捕集、除盐等步骤可自动完成，大大降低了微量样品的损失。
[0011]本发明自动化分析系统对少量细胞的样品能够鉴定到较多种类的蛋白，对揭示某些低含量细胞(如循环肿瘤细胞)的蛋白质组信息具有重要作用，有着广阔的临床应用前景。例如本发明的自动化系统用于对100个DLD-1结肠癌细胞的蛋白质组检测，单次平均鉴定到446个蛋白，三次重复实验共鉴定到714个蛋白，其中包括肿瘤特异性蛋白和17%左右的膜蛋白。本发明对于揭示微量细胞的蛋白质组信息具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为自动化分析系统的结构示意图(为阀的一种切换方式)。
[0013]图2为自动化分析系统的结构示意图(为阀的另一种切换方式)。
[0014]图3为酶解反应进行程度的考察图。通道I是没有加trypsin的细胞样品，通道2到5依次代表酶解0.5h，lh, 2h和4h的细胞样品，样品跑SDS-PAGE胶并进行银染，如果在蛋白相应分子量区域看到条带，表示有蛋白质存在。由图可以判断2小时细胞得到完全酶解。
[0015]图中标号:I为十通阀第一位置，2为十通阀第二位置，3为十通阀第三位置，4为十通阀第四位置，5为十通阀第五位置，6为十通阀第六位置，7为十通阀第七位置，8为十通阀第八位置，9为十通阀第九位置，10为十通阀第十位置。
【具体实施方式】
[0016]通过实施例对本发明提供的自动化分析系统在微量癌细胞蛋白质组分析中的应用作出进一步说明。
[0017]实施例1自动化分析系统的构建
装置中的十通阀第一位置I与20yL的注射针相连，并且由可以精切控制推或拉的体积的注射泵控制。第二位置2与一根1cm长、250 μ m内径的毛细管相连，作为细胞与酶混合溶液的进口。第三位置3和第十位置10之间连着一根16cm长、250 μ m内径的毛细管，作为细胞的酶解样品环，体积为8 μ Lo第四位置4和第七位置7之间连着一根C18捕集柱，制作方法简要地说，在一根1cm长、75 μ m内径的毛细管一端用溶胶_凝胶法制作柱塞，然后填入Icm长的C18填料并活化。第五位置5与超高压二元液相泵相连。第六位置6与15cm长、75 μπι内径的毛细管反相柱(5 μπι, ΙΟΟΑ)相连，并进而连接到Q-Exactive质谱仪。第八位置8与通向废液的出口相连。第九位置9与液相泵系统中的上样泵相连。
[0018]实施例2细胞与酶混合溶液的配制
把人结肠癌细胞DLD-1培养收集之后，用PBS稀释成40个/^L的浓度，加入50mM碳酸氢铵、200mM盐酸胍和5ng/^L胰蛋白酶后配制成细胞酶解液，精确计数，并且根据计数结果确定进样体积。
[0019]实施例3细胞的在线酶解
使用注射泵将细胞酶解液吸入十通阀上的样品环内，切换阀的位置，使样品环两端封闭，置于50°C的柱温箱2小时，期间对样品环超声振荡若干次，完成酶解。
[0020]实施例4肽段的捕集与除盐
切换阀的位置，样品环一端与泵相连，一端与捕集柱相连，通过泵的推动，将肽段富集在C18捕集柱上，并进行除盐纯化。
[0021]实施例5液相色谱-质谱分析
切换阀的位置，使用液相泵的梯度将肽段逐步洗脱，在15cm长、75微米内径的毛细管反相色谱柱上分离，并且使用Q-Exactive质谱仪检测，使用MaxQuant软件检索蛋白质。
【权利要求】
1.一种用于100个以内细胞的蛋白质组自动化分析系统，其特征在于，以一个可切换的十通阀为中心，与注射泵、多元梯度泵、质谱仪、上样泵、毛细管道连接组成；十通阀的内部通道直径为50-250微米；其中，十通阀的第一位置与注射针及注射泵连接，第二位置与毛细管连接作为完整细胞与酶混合溶液的进液口，第三位置和第十位置之间连接体积为1-5微升的毛细管，作为细胞的酶解样品环；第位置四和第位置七之间连接肽段的捕集柱；第位置五连接液相色谱的多元梯度泵；第位置六连接质谱仪；第位置八连接废液出口 ；第位置九连接上样泵。
2.根据权利要求1所述的蛋白质组自动化分析系统，其特征在于，所述的肽段捕集柱的结构为:在5-20cm长、20-75微米内径的毛细管中采用溶胶-凝胶法制作双柱塞，双柱塞中间填入3-10毫米长的C8或C18填料。
3.一种基于权利要求1或2所述自动化分析系统的蛋白质组分析方法，其特征在于具体步骤如下: (1)把细胞培养收集之后，用PBS稀释成10-100个/^L的浓度，加入碳酸氢铵、盐酸胍和胰蛋白酶后配制成细胞酶解液，精确计数，并且根据计数结果确定进样体积； (2)使用注射泵将细胞酶解液吸入十通阀上的样品环内，切换十通阀的位置，使样品环两端封闭，置于柱温箱或水浴中，37°C?50°C的温度下保持I?4小时；期间对样品环超声振荡若干次，完成酶解； (3)切换十通阀的位置，使样品环一端与上样泵相连，一端与捕集柱相连，通过上样泵的推动，将肽段富集在捕集柱上，并进行除盐纯化； (4)切换十通阀的位置，利用多元梯度泵的梯度将肽段逐步洗脱，在毛细管反相色谱柱上分离，并且使用质谱仪完成对肽段的检测。
4.根据权利要求3所述的蛋白质组分析方法，其特征在于所述细胞酶解液配方为:在分散于PBS缓冲液中的细胞液内加入20-100mM的碳酸氢铵，50-500mM的盐酸胍，l_10ng/^L的胰蛋白酶。
【文档编号】G01N30/89GK104483434SQ201410702227
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月29日 优先权日:2014年11月29日
【发明者】张祥民, 陈奇, 晏国全 申请人:复旦大学