专利名称：：自动化细胞培养系统及方法
技术领域：
：本发明概言之涉及细胞培养领域，其是一种主要用于细胞生长、增殖和繁殖以供进行分析以及用于产生及收集细胞产物的实验室方法。本发明包括经官能化及/或改造的水凝胶微载体，其可展示下述任何或全部特性可控浮力、铁磁性或顺磁性、分子元件或装配的报道元件及光学透明度。该等微载体可用于一使用外力来控制所述微载体动能及平移或位置方位的生物反应器中以利于细胞生长及/或细胞分析。所述生物反应器可作为一采用下述任何之一或全部的自动化系统的一部分一种微载体制造方法、一种监测方法、一种细胞培养方法及一种分析方法。在所述自动化系统中使用一单一生物反应器或复数个生物反应器能够在最少人类干预下进行细胞培养和分析。
背景技术：
：本发明概言之涉及细胞培养领域，其是一种主要用于细胞生长、增殖和繁殖以供进行分析以及用于产生及收集细胞产物的实验室方法。通常将活细胞接种于一位于一生长培养基中的塑性表面上，所述培养基中包含许多营养成份及呈其自然状态的生长因子。然后将位于一塑料容器(例如培养皿或烧瓶)底部上的这些细胞置于一培养箱中，此培养箱可提供一温暖、潮湿及适当充气的生长环境。实质上对可培养细胞的数量和种类以及可自培养物中的细胞获得的有价值产物和数据没有限制。经培养细胞可用于筛选具有潜在医药活性的大型药用化合物库，且自经培养细胞分泌的蛋白质及核酸可具有作为医药产品的显著价值。此外，细胞培养具有宽范围的实验室研究应用，例如医学实验室中的药物开发程序以及用于细胞治疗的人类、动物和植物细胞。传统细胞培养体积取决于是否使用平底皿使细胞生长于其上。培养皿及其它细胞培养用具可提供一表面，其上可附着及生长贴壁依赖性细胞。传统培养皿具有78.5cm2的表面积且当充分铺满时可支持1><106个以上细胞的生长。对培养皿的改进包括使用细胞瓶、滚瓶以及使细胞生长于培养容器中的纤维上。人们已开发了微载体来代替使细胞生长于生长培养基容器或培养容器的表面上。微载体可使用各种材料生成，例如，塑料、玻璃、明胶和藻酸钙(2，3,4,5)，以便增加其上可用于生长细胞的表面积。然而，必须对微载体进行搅拌以使细胞生长于其表面上。先前技术阐述了需要一悬浮叶轮的旋转瓶，该叶轮由一位于该旋转瓶底部的外部旋转磁铁驱动以使此等微载体保持悬浮状态。然而，叶轮可向生长中的细胞赋予流体动力应力(6)，此可损伤细胞或改变其形态。叶轮通常悬浮于细胞培养基中且通过对一顶置马达的直接耦合或通过一位于培养瓶支撑物底部的旋转磁铁的磁感应加以搅拌。叶轮可能会较为昂贵，因为其必须由能够清洁及消毒且不会将任何污染物质带入细胞培养基的材料制成。此外，大部分实验室以人工方式进行习知细胞培养，包括解冻来自冷冻机的细胞、将其接种于一培养容器或烧瓶中、对其进行喂养及分裂以最后使其与酶分离或脱离以供进行分析并在必要时进行冷冻。因此，需要在细胞培养、维持及分析期间的细胞处理方面改进习知细胞培养，并改进培养中的细胞的状态或健康以及细胞生长条件从而在某些情况下使细胞生长于一更类似于细胞自然生长环境的环境中。该生长条件方面的改进将提供更精确的分析及观测结果，因为细胞培养条件将会模拟或更精确地代表细胞在获得此细胞的初始生物体(例如，人类、非人类哺乳动物、动物、植物及其它)中的生理条件。在减少操作步骤方面，在某些实施例中，本发明可将需要用来处理细胞的人力减少约75%，从而消除接种、生长、喂养、分裂及分析细胞或细胞产物等传统操作步骤。
发明内容本发明关于一种适于使细胞生长的经改造微载体，所述微载体包括一能够提供一基质以支持细胞在培养物中生长的水凝胶组合物，其中所述凝胶组合物进一步包括至少一种能使所述微载体响应于至少一种物理力的材料。此等细胞可生长于所述经改造微载体的内部及外部表面上，所述微载体被制造为当用于一细胞培养系统时能够响应于至少一种物理力、由该至少一种物理力操纵或控制。本发明还涉及制造该等经改造微载体的方法及使用其生长细胞以供分析及产生细胞产物的方法。在另一实施例中，本发明进一步涉及一种生物反应器，其包括本文所述且包含于一培养容器或生物反应器中的经改造微载体;及一种用于将一力发送于此培养容器中、周围及/或外部以控制所述经改造微载体在此培养容器内部的运动的来源，其中该来源由一控制系统控制。在另一实施例中，本发明还另外涉及一种自动化细胞培养系统，其包括所述经改造微载体、一培养容器或生物反应器及一用于将一力发送于此培养容器中、周围及/或外部以控制所述经改造微载体在此培养容器内部的运动的来源，其中该来源由一控制系统控制，且生物反应器用于达成培养细胞的目标。本发明的一个实施例涉及一种自动化细胞培养系统及监测系统，其包括所述经改造微载体、一培养容器或生物反应器及一用于将一力发送于此培养容器中、周围及/或外部以控制所述经改造微载体在此培养容器内部的运动的来源，其中该来源由一集成控制系统控制且进一步包括一监测系统以查看、测量、记录数据及将数据传送至一用来控制该过程的集成计算机处理器或生物芯片处理器。图l绘示一习知微球体、一具有顺磁性粒子的微球体、一具有浮力元件及顺磁性粒子的微球体。图2是本发明代表性生物反应器的图形,其中该反应器包括本发明经改造微载体，该图显示外加物理力来源与培养容器和用于添加及去除培养基及/或微载体的开口之间的关系。图3是本发明代表性自动化生物反应器的图形，其中该反应器包括本发明经改造微载体并由一控制系统控制，该控制系统亦控制物理力来源、培养基和微载体通过一开口至培养容器的添加或自培养容器的去除以及监测系统。图4是本发明代表性自动化生物反应器的图形，其中该反应器包括本发明经改造微载体并进一步显示与微载体制造方法(通过该方法可将微载体直接提供于培养容器中)之间的关系及其与任何分析方法(其可自培养容器接收微载体以供进行分析)之间的关系。控制系统可控制处于箱式区域中的自动化培养容器系统以及微载体制造方法和分析方法。图5绘示了使用单一磁铁的一本发明实施例。该图显示如何利用该磁铁使微载体在生物反应器内运动。图中显示了两个生物反应器，其包括一培养容器和一物理力来源即一用于各培养容器的单一电磁铁或永久磁铁。在左图中，以黑色圆盘表示的磁铁向下运动至培养容器的底部以吸引由小圆圈表示的微载体从而通过培养容器右侧的开口排出废培养基。在右图中，磁铁运动至培养容器顶部以吸引由小圆圈表示的微载体从而自培养容器排出微载体。图6绘示了使用一组电磁线圈或磁铁环绕培养容器的一本发明实施例。该图显示微载体可根据其细胞生长需要及有利于更换培养基和抽吸微载体的目的而运动。顶部线圈通电后可使微载体向上运动以便可以人工方式或机械手臂进行抽吸。所有线圈通电后可使微载体保持悬浮状态。底部线圈通电后可使微载体运动到底部以便去除废培养基及添加新鲜培养基。图7左图中绘示了培养基的更换，右图中绘示了微载体的抽吸。该图显示类似于图5中的磁铁应用，但其中具有复数个图6中的磁铁。图8绘示了一替代磁铁布置，其允许根据具体需要来操纵微载体。如图6中所示，顶部电磁线圈可使微载体向上运动以便可以人工或机械方式抽吸微载体，底部电磁线圈可使微载体向下运动以便可以人工或机械方式抽吸掉用过的或废培养基，且所有线圈经振荡后可使微载体保持悬浮状态。图9进一步绘示了用于使各种微载体运动的磁场。该图显示使用两个具有两极或多极的环形电磁铁来达成跨越培养容器的斜线运动。图10绘示了另一替代磁铁布置，其允许对微载体进行更多环形及顶部至底部的混合。图11显示了由外部磁场操纵以产生动能的经改造微载体的示意图。所述微载体绕其轴旋转以对生长于球体外部的细胞产生剪切力，靠近外围的细胞与靠近轴的那些细胞相比将会暴露于更大的剪切应力下，如球体右侧的近似剪切力曲线所示。具体实施例方式本发明揭示了已自习知微载体改造的微载体，其中另外包含可提供特定性质以操纵微载体并使其相对于其它微载体发生物理运动或在培养容器内发生简单运动的添加剂。本发明进一步揭示了其中添加剂是可报告对一刺激的应激或响应的配体、报道子或响应元件的微载体。本发明进一步揭示了使用各种具有实质不受限性质的物质制造的经改造微载体。例如，此等经改造微载体包括但不限于明胶、聚丙烯酰胺与胶原或明胶的共聚合物、具有改变电荷的聚丙烯酰胺、藻酸盐及藻酸盐与明胶的共聚合物。较佳的微载体具有化学构造，例如钙-藻酸盐和明胶，如Kwon等人所揭示(7)。但随后可改造这些习知微载体以产生可作为报道子的经官能化微载体。我们还阐述了化学微载体的改良形式，即拥有特定性质(例如，本文所述的特定浮力和磁性及/或顺磁性性质)的经改造微载体。因此，本发明的经官能化及/或经改造微载体具有已知微载体的性质，这是因为它们是使用己知方法和材料自化学化合物和组合物产生的，但是这些习知微载体经进一步改造或修饰后可包含或包括能够提供这些有利性质的添加剂，例如，粒子、分子及/或气体，其可引入微载体(见图1)或另外附着于微载体外部以引起密度变化及/或通过至少一种外加物理力向位于培养容器内的所述经改造微载体赋予动能以使所述经改造微载体环绕一培养容器或生物反应器内部运动、转向、搅拌或以其它方式受到操纵。钙藻酸盐和明胶微载体特别适用于监测细胞功能，因为自该等组合物制得的经改造微载体具有最低的内源性荧光，此使得可利用显微镜技术来观测细胞，例如荧光聚焦显微镜检查法。一较佳的实施例是与现有其它微载体相比在光学上透明的微载体的产生。揭示于本发明中的较佳微载体可保留较大比例的光学透明度，且即使在使用本文详述的添加剂进行改造后其也不会在功能上干扰对经改造微载体内部或外部的细胞所进行的观测或定量测量。本发明微载体可增加细胞密度，例如，癌瘤细胞可生长到每5xl()S个微载体高达7xl()S个细胞。然而，当细胞已生长到一足够密度时，如由结合于微载体上的报道分子所指示的铺满程度或使用一外部监测系统所测定，可直接使用这些细胞进行研究，因为其包含报道分子且不需要使用酶例如胰蛋白酶实施较具破坏性的过程解除其附着(而平底容器中则需要此过程)。本发明微载体可赋予挠性优点，这是因为其被制造为具有不受限几何、化学及功能性质(8,9)。在本发明某些实施例中，可将微载体制造为任何直径的球体，但更适宜的直径范围是自1毫米直至小于感兴趣细胞的直径。本发明微载体的较佳粒径范围是直径自l微米至l毫米。然而，本发明揭示的自动化细胞培养系统可使用粒径小至不足1纳米及高达2厘米或以上的微载体且该等微载体可使用所揭示技术产生。本发明所用的微载体亦可经化学修饰以使非贴壁细胞附着于其表面上。在某些实施例中，本发明使用一种可使非贴壁细胞附着的技术(io)，且允许至经进一步改造微载体的该附着具有本文所述的特定报告、浮力及磁性及/或顺磁性性质。本发明的经改造微载体通常可用于促进收集作业然而，微载体自悬浮状态降落的倾向使得不能通过自动化方法对其进行容易的收集。微载体产品已投放市场数十年，但是，其难以操纵以及使用其所需的昂贵复杂的叶轮系统或生长容器旋转系统阻碍了人们使用其支持医药工业中的高通量筛选过程的兴趣。在本文揭示的自动化细胞培养系统和监测系统中使用本发明经改造微载体进行高通量筛选可提供优于先前所用高通量筛选系统的优点。在另一实施例中，本发明揭示了使用习知技术来制造或生产微载体，包括将其喷入一包含一聚合性化学混合物的液体中或通过将微载体基质添加至一经迅速搅拌的油浴中以产生一乳液。在本发明的另一实施例中，视情况可在细胞培养自动化平台(见图4)中采用一种一体化方法来制造经改造微载体。目前，尚不存在可制造所需经改造微载体(如本文所揭示自动化细胞培养系统中所需者)的细胞培养系统。该方法可提供一种符合当前需要的细胞培养生产过程。经改造微载体磁性新颖的本发明经改造微载体包含已纳入的浮力元件，该等元件可增加经改造微载体及/或能将磁性及/或顺磁性性质赋予经改造微载体的粒子的密度。使用及纳入微小的磁性或顺磁性粒子允许通过外部磁场来控制此等粒子。对磁性及/或顺磁性粒子的选择允许人们减小将选定运动或动能赋予经改造微载体所需的外部磁场的大小或定向作用。在经改造微载体中纳入顺磁性粒子的好处是当该等粒子未暴露于一外部磁场时不具有固有磁性，因而此可防止其彼此间的附着。在某些实施例中，人们期望使用微载体聚集作用来产生有用的细胞聚集体，例如组织或器官的形成。因此，可通过内部磁性或铁磁性性质的任何组合以及任何外部磁铁(永久磁铁或电磁铁)布置使微载体沿特定方向并以任何数量聚集在一起。在另一些实施例中不期望存在聚集作用，例如在新颖药物的高通量筛选中，其中离散的微载体可产生较高的筛选信号。在其它实施例中，较佳使用顺磁性和磁性材料的组合来赋予某些性质从而允许对一外部磁场产生可变响应。经改造微载体的磁性性质可在制造该等微载体期间受到控制，或在该制造过程之后赋予该等性质。如果微载体在不存在磁场的情况下发生聚合或凝胶化，则磁性或顺磁性粒子将在经改造微载体上或内部具有一随机取向。另一方面，如果在所述制造过程中以静态或变化方式施加一磁场，则可将一特定取向和磁场强度(如果所述粒子可被磁化)赋予微载体上或内部的粒子。例如，但并不意味着限制本发明，人们可能希望向每一微载体赋予一磁性偶极子以便当将存于一液体中的微载体暴露于一外部磁场时该等微载体可绕其轴旋转。如果用户不希望微载体因生长于其表面上的细胞彼此粘附在一起而发生聚集，则施予一轴向旋转将会防止微载体间的聚集。浮力微载体的浮力可通过使用具有浮力性质的材料来制造它们来控制或通过添加一种或多种可控制浮力的物质来控制。浮力在本文中定义为可使微载体在其悬浮于其中的液体中自发地沿一与重力相反的方向运动的性质。在许多可能实施例中的一个实施例中，所制造微载体掺杂有顺磁性粒子和展示净正浮力的玻璃泡二者。该等物质可在细胞培养中将若干物理性质赋予先前未知的微载体。此外，微载体密度可通过使用各种成份(某些具有浮力性质)的组合来控制，以使用于细胞培养的载体的密度在0.8至1.4g/cm的范围内，此允许微载体悬浮于培养基中。制造微载体可在悬浮液中及在油水乳液中使用复数种方法来制造，包括但不限于喷射、超声波处理、悬浮、振动或乳化含有微载体聚合原料的液体。本专利所述的经改造性质(例如浮力控制能力)可通过向微载体原料中添加选定材料(例如玻璃泡)来赋予，因此其可根据用户的需要分布于微载体中。或者，可在己完成微载体制造后添加能赋予微载体选定性质的材料。可将专一性蛋白质纳入微载体基质中或微载体表面涂层中以促进或增强细胞粘附、生长、分化或促进选定表现型的表达，包括生化物质的形态变化以及表达。例如(但不限于)，其中己纳入细胞外基质蛋白的微载体，例如，胶原、纤连蛋白、多肽及可用于产生各种细胞特性(包括上文所述的那些性质)的其它蛋白质和生化物质。或者，已通过使用聚合物、生化物质及其它物质(10-14)对非特异性粘附及细胞特性进行抑制。明胶用于促进细胞粘附于平面载玻片上(15)。先前技术教示了一种用于培养、收集及使用贴壁依赖性细胞的经低密度胶原涂布的微载体方法(16)。然而，本发明揭示了可通过无叶轮方法使用与欲培养细胞的需求相匹配的经改造浮力自动操纵的微载体的产生。此外，本发明的经改造微载体可直接用于需要活细胞的各种应用中，此不同于HiUegas所教示的内容(16)，其阐述了光学上不透明的不溶性微载体。Hmegas的建议中并未教示任何特定或多细胞的使用以及他们的发明对于支持特定细胞生长的固有优点。本发明在Koichi(10)教示的基础上有所改良，其允许非贴壁细胞附着于载玻片上以形成微阵列。本发明的经改造微载体在Koichi方法的基础上有所改良，其改良之处在于其是可悬浮的、经添加剂改造并参与一利用其可在悬浮液中受到操纵的能力的细胞培养过程。该等贴壁培养的优点在于其允许复数种非贴壁细胞锚固于各种基质上(10)，该等非贴壁细胞包括例如血液细胞、免疫细胞(淋巴系列细胞，其可与抗原反应以产生抗体或在细胞介导的免疫性或迟发型超敏反应方面具有活性；其亦被称为免疫活性细胞)、某些癌瘤细胞、干细胞、单细胞生物体及其它细胞。对于本发明的经改造微载体而言，在某些实施例中使用本文所述的步骤将生物相容性锚固材料纳入微载体基质中或涂布于微载体上的表面层上。在一实施例中，一锚固促进材料是油基聚(乙二醇)醚(10)。将此锚固促进材料纳入可在悬浮液中操纵的经改造微载体可提供一种有力的实质上可用于所有贴壁依赖性及无贴壁依赖性细胞的细胞培养技术。或者，可将细胞保持于经改造微载体内部使之处于一允许细胞分化或生长、或使细胞保持于一稳态非生长期的微环境中。然后可使用该等经改造微载体将细胞递送到一选定位置，例如移植于活生物体内，细胞将在此处附着、分化成纯细胞系或扩展以填充一空间或满足一需要。可使用一可分解的或可用酶消化的生物相容微载体将细胞递送至一感兴趣位点，并随后用各种方式对该泡进行消化、破碎、分解、或溶解。此后一种方法的一个实例是通过将超声能量传送至体内或体外泡位置使该等泡破碎。更具体而言，可自许多种物质制造微载体，该等物质包括两大类材料，即热塑性聚合物和水凝胶聚合物。热塑性材料可以是任何水溶性物质，包括但不限于聚丙烯酸酯或聚乙二醇。较为有利的是使用更温和因此对封包于水凝胶物质(例如，但不限于琼脂糖及/或藻酸盐)中的细胞具有更少危害性的制造条件。作为一具体的但非限制性的实例，藻酸盐是一种自褐藻及某些细菌提取的细胞内基质多糖。为改良我们独特的经改造微载体上细胞的存活力，我们从不含内毒素的来源中选择藻酸盐。甚至那些熟悉在藻酸盐微载体上进行细胞培养的技术人员也将会得益于我们对使用含少量或不含内毒素的藻酸盐以改良细胞在微载体上的附着、健康、生长、及存活力的教示。藻酸盐可自Sigma(St.Louis,MO)或PronovaBiomedical(Oslo,Norway)得到，并用不含内毒素的水以一自0.1重量％藻酸钠至10重量％藻酸钠的范围混合于水性溶液中。然而，当藻酸盐浓度为0.8%至1.2%时微载体由于该溶液的粘度而更易于制造。内毒素使用一得自Sigma的Limulus-溶菌分析试剂盒进行测量，并且仅使用具有低于5000内毒素单位/mL数值的藻酸盐溶液来制造在其外部带有细胞的微载体。用于培养细胞的理想范围是一低于500内毒素单位/mL的内毒素水平。将该藻酸盐溶液与一2至4重量％的藻酸丙二醇酯(PGA)溶液(KelcoloidD;ISPAlginate,SanDiego，CA)相混合以交联该藻酸盐[Kwon等人(7)]。该可选步骤可用自0重量％至10重量％的PGA浓度实施。另外，藻酸盐通过其具甘露糖醛酸或古罗糖醛酸或甘露糖醛酸和古罗糖醛酸两者混合物的区域的活性来源来产生。选择其中这些物质的比率可使细胞健康、生长、及存活力最优化的来源。甘露糖醛酸与古罗糖醛酸的比率可通过按照Kkk;k的方法(17)在445rnn处的发射测量。尽管经观察细胞可在任何甘露糖醛酸与古罗糖醛酸的比率下生长，但与钙交联的较佳比率是90%或更高的甘露糖醛酸。额外添加剂包括玻璃泡(3M公司，Maplewood，MN)、蛋白质泡、或空气泡，其量可高达20体积％。然而，我们发现1%至5%的玻璃泡可使微载体具有理想密度并且是能够制造的。空气(或其它惰性气体例如氦)泡可通过剧烈地摇动容器以包裹小的不均匀泡形式空气或通过使用鼓泡器(将压缩空气或气体泵入一可将该气体分成均匀泡的烧结金属装置中)而纳入溶液中。此时也可将顺磁性或铁磁性粒子(Spherotech，Libertyville，IL)包含于该溶液中以赋予所生成的微载体顺磁性或铁磁性特性。高达75%的微载体内部容积可用顺磁性或铁磁性粒子填充，然而，理想比率是从1至1000个粒子/250pm微载体。若期望，此时可添加本申请案其它处阐述的指示剂，例如荧光分子。当该微载体溶液的内容物确定后，可基于所期望生成微载体的具体特性通过包括将藻酸盐/PGA添加溶液逐滴添加至一经轻缓搅拌的1.5%(0.135M)氯化钙溶液中在内的多种方法形成这些微载体。也可使用市售的微滴产生器。也可在制成微载体之前向该混合物中添加活细胞以允许内部细胞封包培养或使用相同或不同细胞对微载体内部及外部的细胞进行共培养。若欲封包活细胞，则可用一生理缓冲液调节该藻酸盐溶液。随后对微载体进行洗涤后用于细胞培养。微载体也可通过向任何体积的微载体悬浮液中添加一1%明胶溶液(例如得自当地食品店的未经调味的Knox明胶)、轻缓搅拌、并随后通过重复更换新鲜的缓冲液对这些珠子进行洗涤而用明胶加以涂布。高浓度的明胶可增加更高刚性，因此我们已经使用了高达10%的明胶，但是0.5至3%对于细胞附着是理想的。将包括可增强细胞附着的分子、可改造细胞的分子(DNA，RNA)、及如本申请案中其它处所阐述的指示剂在内的添加剂置于明胶溶液中。如Kwon等人所阐述(7)，通过添加两体积的0.2MNaOH转酰化至藻酸盐可使该凝胶交联以使微载体具有更高刚性。可纳入多种分子(例如(但并不限于)聚-L-赖氨酸(一阳离子氨基酸聚合物))以增加或降低微载体电荷及/或多孔性(18)。本发明揭示了纳入可控制微载体对物理力响应的物质，该响应在使用了可控制微载体渗透性、多孔性、和强度的物质后得到了改良。通过添加二价阳离子(例如钙(Ca2+))可使藻酸盐古罗糖醛酸分子和因此微载体抱持在一起并增加了刚性并因此增加了强度。依照Strand,(19)所述，可使用钡(Ba2+)将古罗糖醛酸和甘露糖醛酸两者结合在一起，因此Ba"的纳入对于达成更强的微载体性能是重要的。与Strand所教示的使用选定阳离子来增强微载体刚性的技术相反，我们所教示的新颖技术是将B^+用作二价分子键结以避免在检验钙通量及浓度的生物化学分析中使用Ca2+，因为改变钙浓度既会干扰微载体的测量又会改变微载体的完整性。微载体可使用多种方法制造，包括使用配备用以使藻酸盐溶液及添加剂悬浮液薄层状喷射间断的电磁或压电驱动喷嘴。为达成对可影响微载体大小的物理参数(例如流速、振动频率和振幅)的控制，期望使用一市售封包系统。或者，将藻酸盐添加至一快速搅拌的油和包含二价阳离子或交联试剂的缓冲液乳液中。微载体在该乳液中自动形成其微球形状，并随后在搅拌变缓或停止时若其具有一高于所述乳状缓冲液的密度则会自该油中沉淀出来。若这些微载体经制造具有一可浮起的密度，则其可通过离心及自表面吸出或通过将其引至容器侧壁(若其包含顺磁性粒子)而将其自该乳液移除。使用经改造特性以利于使用微载体在悬浮于生长培养基中的标准微载体上培育细胞允许更多地获得营养、空气、或氧气及二氧化碳和相对于重力的无规取向，然而会增加由于不可控制的剪应力所引起的潜在损害。本发明经改造微载体的另一额外益处是其可提供温和的生长条件且没有因经搅拌培养产生的应力或不便。本发明经改造微载体可允许从外部控制每一微载体的特定取向。另外，可容易地且快速地收集该经改造微载体以供用于随后步骤。可用于培养细胞的微载体的数量仅受容器内培养基量的限制。因此，使用所揭示经改造微载体可达成自用于微制造技术(20)中一微小规模培养至超过1升(例如500升)的培养系统的培养规模性。有人已经成功地制造出约5nm的微载体，这些微载体在一中国仓鼠卵巢细胞生长期间可由其部分地包围。此技术PT使细胞在被转移至一微通道流体流中时保持于其锚固表面上或者临时或永久地保持在一平坦表面、三维表面、或阵列上。此外，本发明揭示诸如微磁体、微压力系统、和微检测器等微小规模部件的使用，以仅在微小规模上实施本专利申请案中所阐述的许多相同步骤。本发明的一重要优势是能够在微通道阵列中使用这些经改造微载体可响应的压力或磁力使细胞转向。本发明包括经改造微载体的悬浮培养，保守而言，此可使人们所期望的生产力超过平底皿400倍并超过旋转瓶的两倍。当细胞己经达到一期望的铺满水平(例如覆盖微载体的80%)时，通常需要将这些细胞自所述微载体移除以用于分析。将存活细胞自其锚固表面移除的最常用方法是通过使用一可对细胞用来将其锚固在微载体上的某些蛋白质进行消化的蛋白水解酶(胰蛋白酶)。胰蛋白酶消化不仅可剥除细胞的多种重要细胞表面蛋白，而且其可引起这些细胞暂时休克，此经常会导致自微载体完整释放的细胞的产率降低。为了自微载体释放，细胞亦可能需要一机械冲击(例如通过微载体在溶液中快速减速赋予的能量)。微载体表面具有的微坑越多，那些细胞将越不易自该表面释放或剪切掉。Mundt对自微载体释放细胞的具体技术进行了说明(21)，他教示了使用胰蛋白酶自微载体释放细胞。本发明不具有这些问题，因为本发明微载体经过改造可自发溶解，如Kwon(7)所述，因此可避免因使用非特异性酶自其锚固表面释放细胞所致的攻击。因此，本发明欲涵盖使用自发溶解的经改造微载体，其可与自动化装置一同使用以避免以人工方式执行这些任务的需要。此外，先前未曾有人阐述过在一自动化过程中于一特定时间点和位置溶解微载体的能力。例如，经改造微载体在其转移至一流体流中期间且在一细胞分选器或荧光活化细胞扫描仪中分析之前可部分地或完全地分离。通过利用对微载体特性的外部控制，我们的经改造微载体可更快地分离。例如(但并不限于)，当钙降低至溶液中聚合作用阈值以下时，通过外部施加的振荡磁场可快速地移动磁性或顺磁性粒子，此可赋予增加的内部动能，从而可快速地分离聚合的藻酸盐。通过溶解包含顺磁性粒子及/或玻璃泡的微载体，可回收这些物质以重复利用或防止其对下游过程造成污染或不利影响。这些经改造微载体之另一益处是其可用于采用习知一次性器皿、移液管、培养基、培养箱、细胞分配设备、振荡器、搅拌器、平皿密封器、和分析仪器的习知细胞培养设施中。达成在培养基中的运动传统上通过使用叶轮实现微载体的搅拌(参见上文)。但不使用叶轮搅拌生长培养基具有许多益处。本发明提供了通过使用经改造微载体将动能赋予包含生长活细胞的培养基中的替代方法。将动能赋予生长培养基可确保营养的均匀分配、确保气体至所有细胞的良好交换、和防止经改造微载体结块。本发明提供多种可单独或以任一组合使用的将动能赋予生长培养基的方法。例如，动能可呈现使用一热源的形式，该热源可在生长培养基中引发一热梯度。由于较小密度的受热基质在培养容器中上升，较大密度的较冷基质在培养容器中倾向于下沉，因此热梯度可在培养基中引起运动，并因此而引起这些经改造微载体的运动。该热梯度足以引发动能，但不会对通常可耐受33。F至105。F的生长细胞造成损伤，除非其分别是经低温保护的或经热稳定的。一与环境温度相差1度至高于环境温度40。F的温差可用于引发对流。热梯度可通过一伺服控制器加以控制，因此其可作为热源以将培养基加热至可达成最优细胞生长的温度。亦可将压力施加于这些微载体，此可达成两个目标。第一个目标是使生长于微载体之中或之上的细胞经受一与生长于活体内的细胞所感受压力相同的压力情况。因此，压力脉冲(或随时间变化的压差)可以自然界中可见的速率(例如自每分钟5次直至每分钟500次)施加于这些微载体。所施加压力的第二个目标是压縮纳入微载体的气泡以增强浮力。通过压縮容纳有包含气泡的微载体的整个容器可增加所述微载体的密度，因此在所施加的压力下可导致其下沉，并在降低的压力下可导致其上升。可使用较环境大气压高数个大气压的压力。机械调节微载体浮力本发明另一实施例可利用粒子浮力来增加培养容器或生物反应器中的动能。例如，引入由可压縮气泡构成的或包含可压縮气泡的粒子。可使用各种天然或人造弹性材料来包裹气泡。由于气体较液体更具可压縮性，因此，通过使用一自外部产生的能源(热或压力)压縮气体将赋予这些粒子可变浮力。可利用展示可变浮力的粒子来搅拌包含支持细胞生长或维持的微载体的生长培养基，或可将可压缩气泡引入包含细胞的微载体中或引至其上。调节一外部磁场可使用磁场将动能引入一流体例如细胞培养基中。大磁通量在任一液体中皆可引起微观且最终引起宏观水平的运动。或者，为限制必须产生的磁场量，在一实施例中，本发明揭示将铁磁性或顺磁性粒子引入可通过一外部产生磁场引导其运动的微载体之中或之上。铁磁性粒子本质上可展示一磁场，然而顺磁性粒子仅当暴露于一磁场时才可展示一磁场。这些粒子的运动可引发液体内运动，并因此使支持细胞生长的微载体保持悬浮。顺磁性粒子可附着至支持细胞生长或维持的微载体表面或置于其内部(其中这些细胞生长于该微载体内部或其表面上)以产生一本发明含义内的经改造微载体实例。通过在微载体制造过程期间添加所形成粒子或自溶液沉淀铁磁性材料(或任一可对磁场发生响应的材料)或在微载体制成时将该材料作为一涂层引入可将该材料置于微载体内部或其上。已知磁性材料包括(但不限于)铬、铁、镍、和钴以及其氧化物或衍生物。这些材料可以微细奈米粒子形式按自0至75重量％添加以提供对光学特性的较小干扰，或作为一大的核心添加以使微载体周边的光学特性得以保持。磁场可通过使用一置于细胞培养容器上部、底部、或侧面的永久磁体或电磁铁加以调节。磁铁位置将视所期望的微载体运动而定。当期望在容器内达成一特定的微载体取向时(例如(但并不限于)使经改造微载体到达容器底部以允许抽吸基质，或使微载体到达基质表面以将其收获)可连续施加磁场(参见图5和7)。所施加的磁场可具有不同的暂时或强度曲线。例如(但不限于)，使磁场脉动有利于使微载体保持悬浮状态(参见图5至10)，然而此会限制由一电磁铁产生的热量或一永久磁铁的机械运动量。可施加混合磁场，如此具有深穿透强度的场可赋予微载体的选定运动或取向，然而同时可使用一具有较小穿透强度的更强场以使微载体保持于一选定取向。图12显示一其中垂直条代表以一环型形式围绕容器周围布置的条形磁铁的实施例。通过计算机控制的对这些磁体的活化和其极性的变更，可达成多种不同的微载体路径以进行搅拌、基质更换、细胞附着操作、或细胞收获。视细胞类型和所需生长条件而定，可使用上述技术的一组合来最优化细胞的生长和维持。例如，在一实施例中，本发明利用了顺磁性粒子和泡两者，将两者同时引入同一微载体中以获得一经改造微载体，该微载体具有这些顺磁性粒子和泡两者赋予该微载体的混合特性。顺磁性粒子和泡的此组合可赋予控制浮力的能力以及使用一磁场以搅拌和引导这些磁性粒子在生物反应器内的运动及/或取向的能力。因此，经改造微载体可根据控制动能、密度、对外部施加磁场的响应、和取向的需要来制造以满足各细胞类型的特定需要。例如，可将一外部磁场施加至包含细胞和经改造微载体的培养基从而将一具有漂浮特性的经改造微载体吸引至培养容器底部以允许初始细胞附着。随后可将该磁场去除以允许漂浮的附着有生长细胞的经改造微载体上升进入生长培养基中。在一髙通量系统(HTS)中直接使用密集的经改造微载体当本发明经改造微载体密集有细胞后，可直接将其用于生物化学或生理学程序。使用微载体的固有特性或通过使用自动装置将经改造微载体移动至一特定位点的能力允许将其用于后续研究或研发程序中。例如，使用其浮力及/或热对流促使经改造微载体移动至细胞培养容器或生物反应器上部将使其可由一自动化移液管或其它收获细胞的构件获得。或者，可通过一外部施加磁场或引发较低密度将经改造微载体集中至生物反应器顶部以供一移液管抽吸。本发明的另一实施例是使微载体移动至该生物反应器的一液体端口以便将其浓縮并随流体流泵出以用于后续程序中。经官能化微载体对于在细胞培养实验室中生长的经培养细胞进行的生物化学程序或分析具有包括研究、产品幵发、和药物研发在内的多种用途。通常，为了研究细胞的各细胞器或细胞产生的生物分子，必须对细胞进行消化或以其它方式离解或分割。近来，已经自研究全细胞的能力中获得了"高含量"发现或筛选。人们已经开发出新颖的细胞培养板以使细胞附着至一欲通过细胞内荧光报告分子检验的表面上。然而，在平皿上生长的细胞不具有与原位细胞相比相同的表型或特性。相反，于微载体上生长和维持的细胞已经显示是经极化的，可展示与其原位细胞更相同的表型，并可产生更大数量的细胞产物。人们己经开发出细胞分选器或荧光活化细胞分选(FACS)仪器来研究悬浮细胞。将悬浮的细胞移至一位于一光学检测器前面的一狭窄流体流中以便测定大小、荧光、及/或电特性。遗憾的是，当将贴壁依赖细胞置于一其未锚固的环境中时，其经常展示负特性。当前制造的经改造微载体足够小，以便通过微载体基质支持各细胞。因此，本发明经改造微载体可用于细胞计数和分选仪器操作。经改造微载体的顺磁性和漂浮特性亦可用作一将细胞自其液体环境分离、分选细胞、或测量对刺激响应的方法。对习知未改造微载体或对本文所阐述经改造微载体的一改良是使这些微载体官能化，以使其包含可报告一刺激及/或对一刺激的响应的配体及/或结合分子。例如，可使一包含一收缩性蛋白的微载体在受到一来自细胞或该细胞培养生物反应器控制器的刺激后收縮并改变其浮力。配体、报道子、或响应元件可以共价或非共价方式链接至微载体的表面及/或内部。报道子可由纳入微载体之中或之上的微(或毫微)电子元件或微(或毫微)机械元件组成，其可通过电磁方法(例如(但不限于)无线微粒)进行报告。配体可用来引发一来自生长在微载体任一方位(外部、内部、或两者)的细胞的反应。可用报道子对微载体实施官能化，以便其在培养基发生变化或自细胞排出或分泌的材料产生变化时可报告其环境变化。在一实施例中，报道子可指示一反应的存在和进程或对刺激的响应。许多发光报道子可以荧光分子和生物发光分子形式使用。对报道子的选择将根据欲进行的测量而有所改变。例如，在一实施例中，可将一针对钠的钠敏感报道子置于细胞内部以报告细胞内的钠。同样，可将一钠敏感染料纳入至微载体中，以便报告由细胞泵至其位于微载体表面上或内部的锚固表面的钠。报道子可以是有机的、无机的、和单或多分子、可直接链接至微载体之上/内部、或链接至一首先链接至微载体之上/内部的官能团。我们的官能化微载体以报告或响应的方法与先前技术(15)所述不同，其不同之处在于我们的微载体设计用以支持可释放目标分子的活细胞。并且，本发明揭示使用可响应并改变微载体环境的分子，例如在一实施例中的收縮性元件。经改造微载体可用于医药公司和基础研究者所关心的复数种分析中。例如，人们对测定癌细胞转移的能力和测定细胞用于结合、穿透、和移动至外部组织的机制非常感兴趣。细胞迁移及/或转移分析可用于发现或精制新颖抗癌试剂或用于检测动脉在发育组织中如何形成。本文所揭示的经改造微载体设计为可根据生物化学分析来测量细胞迁移或侵入。在一实施例中，微载体中的癌细胞分裂可通过测量细胞数目或一由于细胞分裂发出的信号来加以监测。例如，在该实施例中，对细胞表面蛋白敏感的报告分子可聚合成微载体的核心。当生长于微载体表面上的细胞朝向该核心穿过时可测量到一荧光指示分子的增加或减少。因此，信号强度与细胞迁移或侵入的能力和活动性相关联。在另一实施例中，微载体用一类似于基膜或其它可被生长于该微载体上的细胞侵入的生物学屏障的物质涂布。将细胞共培养于微载体表面上及/或内部，以便可测量自一外部细胞层朝向微载体中心的侵入，或可观察和测量到细胞远离微载体核心向外侵袭。或者，将包含潜在侵入或迁移细胞的微载体引向生长于另一微载体上的其它细胞(使用一磁场或浮力)以观察和测量自一微载体至另一微载体的侵入或迁移。此外，还可使用重力、浮力、热梯度及/或磁力将微载体引向生长于一习知贴壁依赖表面(例如(在另一实施例中)习知培养瓶表面)上的细胞。当其到达一特定间距时，则对细胞自该表面至该微载体或自该微载体至该表面的迁移或侵入进行测量。使用本发明经改造微载体可测量剪切应力对细胞生理学或生物化学的影响。一旋转微载体将把剪切应力赋予位于其表面的细胞上(参见图ll)。因此，可根据一外部施加的可引起微载体内部或外部动能变化的磁场(例如，在一实施例中，依照一用户可编程的速度曲线、方向、幅度和瞬时曲线(例如脉动、斜坡、方形波线、和用户可定义的其它曲线)的旋转)来测量细胞内生理学或生物化学的变化。本发明经改造微载体可用于模拟血脑屏障。大脑是一个难于递送活性药理化合物的地方。为确定血脑屏障如何将大脑与循环血液隔开，人们已经对此屏障进行了积极的研究。因此，本发明经改造微载体和培养系统在可模拟血脑屏障并允许其研究的方法中提供了一医药研发模型并建立了一活体外血脑屏障模型。在此实施例中，使大脑脉管内皮细胞在经改造微载体上生长，该等微载体可用于测定培养基中有多少选定化合物到达这些细胞内部及/或微载体核心或微载体中有多少化合物到达这些细胞内部或被排出至微载体细胞层外部到达一报道子层或培养基。在任何实验室中皆可使用经改造微载体容易地运用此模型。在另一些实施例中，经改造微载体用作干细胞附着表面，其中这些干细胞取自例如(但不限于)脐带血、脂肪组织、胚胎、和末梢循环等多种来源。所模拟的微重力环境有利于促进干细胞维持或分化成子代细胞。生物反应器FDA当前核准的可应用于人类的生物医药产品在100种以上，其创造了超过1000亿美元的市场价值，同时年增长率超过100%。生物反应器或培养容器用于在经最优化以利于细胞生长的条件下产生蛋白质(22至31)。一旦细胞在一生物反应器中达到最大密度，对于营养物质及氧气的竞争就会引起细胞死亡，此可导致系统低效。大部分生物工程学者认为生物反应器己臻成熟，因此正在寻求更为有效及最优的方法。中空纤维生物反应器(或基于灌注的系统)已使蛋白质生产得到改善，但仅仅用于可分泌感兴趣蛋白质的细胞。当培养物成熟时中空纤维系统会被死细胞产物阻塞，从而导致产量与许多批式系统的产量相比有所降低。因此，迄今为止，仍没有一种技术能够获得最优细胞生存力和蛋白质生产率。为生产感兴趣的蛋白质需使生物反应器运行长达120天之久。因此，需付出大量人力来监测与保持最优反应器条件(pH、营养物质水平、温度、溶解气体浓度)。通常，不将细胞从生物反应器中去除。随着过程的持续进行通过添加营养物质或调整条件来维持这些大批量生产过程。当从生物反应器中取出液体并送交实验室进行分析时，会引起监测的间断。理想情况是应在细胞水平上实时进行细胞生长和代谢的监测。本发明自动化细胞培养系统包括如本文所述的经改造微载体，所述经改造微载体具有一加至其结构中的指示剂，所述指示剂能够使每一经改造微载体报告生长于其表面(或内部)的细胞的健康和生长状况。通过使用指示剂能够在每一生物反应器模块上安装一闭环控制系统。在我们的实施例中，本发明经改造微载体得到改造后能够通过向微载体自身基质中纳入指示剂而报告细胞水平上的微观状况。例如，这些指示剂可以是但不限于用于指示pH的荧光指示剂和用于指示氧气、二氧化碳、葡萄糖、尿素、碳酸氢盐、乳酸盐和氨的指示剂，可将其纳入每一微载体中并通过生物反应器或培养容器加以监测。或者，可使用一习知流通分析系统来监测培养基组份。本发明生物反应器利用经改造微载体可经搅动、旋转、加热、冷却、充气(用特殊气体混合物)、加压、暴露于磁场(或恒定或在电磁波谱任一部分(包括但不限于的近红外到远紫外波谱)中变化)的能力来移动和搅拌微载体。本发明另一实施例是一基于经改造微载体的包括单个或复数个小孔或开口的生物反应器，所述小孔或开口可使一次性细胞培养容器保持直立(垂直)或侧卧(或水平)状态。可通过小孔或开口之一将微载体导入盛装在生物反应器中的细胞培养基中，以影响非贴壁细胞(诸如例如，源自草地粘虫(Sp^^/7^ra/h^Zp^Y^)的SF9昆虫细胞)悬浮细胞培养物中动能的增加。生物反应器也包括至少一种用于产生所述微载体可对其作出反应的至少一物理力的来源。在又一实施例中，上述生物反应器可进一步包含使微载体漂浮在生长培养基中并操纵微载体所必需的一或多种元件，称作控制系统。所述控制系统可由人工操作的硬件组成。控制系统可经改良以包括能够自动操作的机械系统。所述控制系统可经进一步改良以包括软件和控制电子设备以使其成为完全自动化操作系统。例如，硬件和控制电子设备以及软件能够提供加热元件，藉此可通过热梯度使微载体漂浮(热控制系统)。生物反应器可包含硬件、控制电子设备和软件以提供磁场，藉此可使微载体移动、旋转及/或保持静止(磁控制系统)。可通过使用自动装置、伺服系统及其它方式移动永久磁铁来改变磁场。或者，可采用受软件控制的固定或可移动电磁铁来操纵微载体。硬件和控制电子设备以及软件可提供通过其使得压力变送器能够改变生物反应器上的压力进而通过压缩微载体中或其上所含的气体来改变微载体密度的方式(压力控制系统)。可向容器上施加短暂或特定压力梯度或曲线来模拟生物剪切力或压縮应力进而研究细胞反应，或诱发细胞产生特异性蛋白质或展现所选特性。这些控制系统中的每一种皆可在单个生物反应器上进行操作，或单个控制系统可在复数个生物反应器上发挥其作用。或者，复数个控制系统可操纵复数个自动化生物反应器。生物反应器的容量可通过简单地增加生物反应器的尺寸或数目而增加。利用磁场操控微载体取向及/或运动不同于利用电磁场刺激细胞至微载体的附着，如Wolf所教示(32)。在前一种情形中，我们的磁场可使微载体的动能发生改变，在后一种情形中，Wolf可增强细胞对微载体的附着。在一实施例中，本发明使用呈线性排列且与生物反应器成直角取向的电磁线圈来产生一适于使铁磁性微载体维持悬浮状态的线性磁场(参见图6)。可通过控制电流、线圈半径、线圈匝数、导线直径、线圈数和线圈间距来改变磁通量和磁力线形状。使用电磁法时，电流可在O.l安培与100安培之间变化。匝数可在一匝至适合环绕细胞培养流体柱的空间的多匝范围内变化。间距可有所变化以使在15cm长度内仅有一个线圈或有数百个线圈。线圈直径可与细胞培养管直径一般大小到尽可能的宽，以使磁通量仍可使微载体运动。先前已教示可使用磁性线圈来控制顺磁性微载体(33)。然而，其教示的内容是利用这种技术使包含酶的微载体在一运动场中保持静止以纯化废水而非进行细胞培养。自动化细胞培养过程是一项繁杂的劳动密集型工作，其具有高错误率且易于被操控此过程的人员所污染。许多细胞培养物和细胞培养设施会受到通常源自实施细胞培养的个体的支原体、真菌、酵母和其它有机体的污染。在细胞培养过程中，研究人员和技术人员将花费大量时间在无菌环境下给料和亚培养活细胞。除人力成本外，细胞培养还是一消耗大量无菌塑料移液管、培养皿、培养基瓶及其它相关材料的高消耗过程。人们己利用机械手来实现目前人工操作步骤(37)的自动化(34至36)。例如，在实施习知细胞培养的过程中，首先将细胞自冷冻原液(保存在-8(TC至-150。C下)中解冻。将解冻的原液置于存于12mmx75mm的一次性无菌培养瓶(通常称作T75)中的细胞培养基中。将所述培养瓶置于一培养箱中以使细胞附着在瓶表面并开始分裂与生长。为维持生长率和细胞生存力必需连续给料(例如每周三次)。给料包括使用导入培养瓶的一次性无菌塑料移液管仔细抽吸出废培养基。然后仔细导入新鲜的热培养基以使生长细胞不受到干扰。当细胞已达到适当铺满度时，就可将细胞移出培养瓶备用。细胞移出包括通过机械或酶解方法剥离或分离。在任一情形中，进行这些步骤时细胞会受到物理损伤或被剥去细胞表面蛋白。为繁殖细胞，通常通过酶解方法从器皿分离细胞并将其冷冻以备长期保存。本发明揭示了通过使用下述组合来实现细胞培养的自动化用于生长细胞的微载体或经改造及/或经官能化微载体、包含并支持使用这些微载体的生物反应器和一能够操控微载体、流体、气体和生物反应器部件的自动化系统。所述自动化系统也可包括装备有过程控制软件的计算机系统以操控自动化细胞培养过程并提供系统进程相关数据。使用复数个传感器来监测自动化系统的运转和环境条件以维持对各过程的反馈控制。生物反应器需要微载体的独特性质，且自动化配置依赖于生物反应器和微载体的性质。借助于自动化，可减少或消除细胞培养所涉及的许多人工步骤(包括接种、生长、给料、分离和分析)从而减少污染。此外，由于使用微载体不必进行细胞剥离或酶解消化，因此可将更为健全的细胞直接引入下游过程，诸如药物研发。自动化系统还可支持用于蛋白质生产的细胞连续培养。所述自动化系统包括多个微载体或一微载体制备装置、生物反应器、可选监测系统、可选控制系统、移动液体的方法、培养容器和一次性培养器具。机械装置可提供一种接达支持使用本发明微载体的永久性或一次性培养器具的方法。在一实施例中，根据上述至少需要一盛装细胞培养基且允许液体处理设备接达的杯形塑料培养容器。如果自动化系统存在于无菌环境中，那么可使所述容器呈一开口容器形式。可通过习知方法达成无菌状态，所述方法包括但不限于使用紫外光杀灭活微生物、花粉和孢子、空气中的细菌、真菌和病毒，或通过使用配备的HEPA过滤器除去超过一规定大小的所有粒子。或者，可将细胞培养容器封闭，但设有一小孔或开口(如在一隔膜中)以允许一工具在培养容器保持封闭状态时来回进出。隔膜是一整合至培养容器上的装置，其可作为向培养容器中添加或从培养容器中去除物质的端口。所述隔膜可由一可刺穿橡胶帽(能够为一刚性移液管穿透)封盖。当拔除移液管或注射针头时，橡胶帽重新封闭。培养容器可以是刚性的，仅允许气体在开放端进行交换，或可用一种经改造能够允许气体(诸如C02和02)自由交换的材料制成。在一实施例中，采用多氟化培养袋(AmericanFluoroseal公司，Ga池ersburg，MD)，其具有极好的气体交换性而不会引起液体的交换或损失。培养袋可用于任一设计为支持培养袋的容器中，包括可容纳培养袋的标准50mL离心管或一较大刚性结构容器。在一实施例中，在一50mL离心管上钻孔以允许气体自由交换。使用多氟化袋可允许在自动化系统内进行连续生产并通过隔膜向细胞培养容器进料，所述隔膜封闭于多氟化塑性袋中且可通过管或容器(其中装有所述袋)帽插入并封闭成帽。例如(但不限于)，可通过激光熔化(或焊接)将一巻多氟化薄片物品制成一培养容器。所述自动化系统包括一可将液体移入和移出培养容器的构件。例如，可使用一配有移液工具的悬挂式直角坐标型机械手(Cartesianrobot)从培养容器中吸出液体或向培养容器中补充液体。或者，一圆柱型机械手、关节式臂杆、Stuart平台或其他机械手自动化系统可装配液体处理硬件。此外，在一实施例中，可提供一利用经改造微载体顺磁性性质来促进培养基移除的构件。例如，可在借助于磁力将顺磁性微载体吸引至培养容器底部后移除培养基，如先前在图5和图7中所示。一旦去除培养基，移液机械手就会通过下列方式将新鲜培养基补充进培养容器中使用足够体积的移液管，使用自培养基源至培养容器的多个行程，或通过使用配有泵的移液管将培养基连续分配至培养容器中。可在进行培养基补充活动之前、期间或之后去除微载体吸引区域附近的磁力。所述自动化系统可包含实施培养操作所必需的所有硬件，或可利用生物反应器(如上所述)来实施培养过程的各个步骤。培养容器也可配有供与培养基直接相连的液体使用的进出端口，该连接可通过伸入容器开口中的管或通过在容器制造过程期间就已安装的直接通向培养容器的连接来实现。当需要将液体泵出或泵入容器时可将微载体移至远离端口处，或当需要收集微载体时可使其朝向端口运动。微载体的运动可通过对流、微载体浮力或通过使用其顺磁性性质来实现。将整个自动化内部环境维持在适合于各种细胞类型的适宜细胞生长温度、湿度和气体浓度下。或者，可对自动化系统的选定部分进行环境控制。自动化系统中可使用生物反应器系统或子系统来提供适宜条件以优化独特微载体的使用。自动化系统中的事件发生顺序与实施人工细胞培养所经历的事件顺序相类似。起初，细胞培养使用者将向自动化系统中递送一小瓶冷冻或生长细胞。较佳地，对所述细胞瓶进行条形码编码，以使条形码读取器能够确立所述小瓶的身份，且随后将这一信息与预先建立的关于诸如细胞、操作员、微载体类型和生长条件等内容的数据库相匹配。所述小瓶也可配有一射频识别芯片(RFID)或其他标记方式。可将所述小瓶置于一呈一窗口、端口或小孔形式的输入装置内。一机械组件可获取所述小瓶并将此小瓶转移至一能够将此小瓶加热至37'C的装置中。加热装置应构造为可展现一受控可重现解冻曲线。此外，还可将对小瓶外部灭菌的方法设计于系统中，所述方法诸如(但不限于)将小瓶浸浴于乙醇、异丙醇、漂白剂、过氧化氢，或暴露于气体等离子中。在受控解冻和小瓶灭菌后，可去除小瓶盖，或在无菌条件下用一机械手移液操纵装置上的移液管刺穿小瓶。用一移液管吸出内容物且随后转移至无菌培养容器中。可在处于受控生长环境(培养箱)中时或在将培养容器置于培养箱之前将微载体、培养基和生长因子导入培养容器中。使微载体和细胞的混合物于培养容器的培养基中静止至少1小时，以使细胞能够附着至微载体表面。使细胞附着至微载体上的时间长度将视拟培养细胞的类型而定。一旦细胞已附着至微载体上，就可利用先前所述的复数个物理力中的任一种搅拌或移动细胞培养基内的微载体。当细胞生长时，视情况可利用复数种方法来监测细胞生长。多种方法经测试表明其可用于测定由生长细胞覆盖的微载体表面百分比(平均值)。例如，人们可利用(但不限于)任何数量的习知分析，诸如在任一电磁波谱波长处的光谱法、直角光散射、图像分析、测量细胞自体荧光、拉曼(Raman)光谱法、质谱法、蛋白质表达、吸收或排除活性染料的能力、胸腺嘧啶摄取和其它用于测量细胞生长的方法。一旦细胞已达到铺满状态或已停止于任一生长状态，人们就可使用诸如(但不限于)离子转运、胞内pH和钙吸收等技术监测细胞健康和状态。一旦细胞已达到其期望的铺满或生长状态，就可收集细胞以用于各种用途，包括药物研发、研究和细胞产物生产。或者，可利用细胞作为蛋白质或细胞产物工厂，且可通过自动移液管或泵收集培养基。在停止使用搅拌构件后可通过各种方法收集微载体。本文中搅拌并非仅意指一环形运动，而是指任一可将微载体维持在悬浮状态下的运动。可自培养容器底部或培养容器顶部收集微载体，其分别视人们是使用下沉微载体还是使用可漂浮微载体而定。相反地，可自细胞培养系统顶部或底部收集培养基，此视微载体是在顶部还是在底部而定。人们通常需要在微载体不存在的情况下收集培养基，或在极小量培养基中收集微载体。可将在所收集微载体上进行的细胞分析直接用于各种产物生产过程或生物分析中。或者，如上所例示，可使用化学或酶解方法解离微载体。在藻酸钙的情形中，微载体在低Ca"培养基存在下会自发溶解。自动化系统配有收集细胞或细胞产物并将其直接转运至下一过程所需的机械系统。这个特征将免除对实验室技术人员劳动的需要，并且可以降低细胞污染的可能性。或者，可直接在微载体上或在已从微载体上解离之后收集细胞在-15(TC下长期冷冻保存。可将自动化系统设置为通过使用一自动化冷却装置来实施受控冷冻方案。一旦细胞已根据标准冷冻方案冷冻，就可将细胞在-80'C冷冻箱(TechCell，Hopkinton，MA)或在一-15(TC冷冻箱中短期(l个月或更短)保存，或直接置于液氮冷冻箱中。通过对含有细胞的微载体脱水至支持细胞停止生长的状态可免除对冷冻箱的使用。在微载体上使用细胞邻生物学(Orothobiologics)是培养用于替代或修复的结构化组织的领域。本发明的经官能化及/或经改造微载体可用于支持欲用于植物、动物、或人类自体或异体移植的细胞的生长和分化。植入组织应支持细胞在一最终可被吸收且可被身体自身的支持基质替代的基质上生长。可培养多种细胞以供用于活生物体中。在人类中，可购得的替代活细胞包括用于组织替换及/或覆盖的软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、软骨形成细胞、多功能造血干细胞和粘膜细胞。本发明微载体培养技术(经改造微载体、生物反应器、和自动化平台)提供一更好的细胞来源以供在人类和习知培养细胞中进行组织替换。在本发明经改造微载体中产生的细胞能达成更快的细胞生产、更小的因剪切应力和叶轮碰撞产生的损伤、实时监测细胞生长并最佳化生长条件和在完全自动化和无菌环境中引发并维持培养的能力。此外，当使人类、动物、或植物细胞生长于经改造微载体中时，其可直接注入组织来修复或替代细胞。在此情况下，将使用已由FDA核准可移植于人类中的顺磁性粒子。或者，在注入前使用一强磁场将顺磁性粒子自微载体剥离。玻璃泡具有生物学惰性，然而，对于可注入微载体而言使用气泡更好。动态操控经改造微载体的能力可允许形成可具有更佳活体内存活力的微载体聚集体，或当将其置于活生物体中时可操纵微载体。下文提供上文中还未揭示的下列额外实施例以在该揭示内容范围内对本发明加以阐述具有固有物理特性的微载体1、一种制造具有多种形状和组成的具有固有特性以使其可对外力进行响应的微载体的方法(例如，但不限于，微载体具有固有的偶极子矩以使其可对一电场及/或磁场进行响应；具有固有的可压缩性和浮力以使其可对压力变化进行响应；和具有固有的自发荧光性以使其在用恰当装置进行测量时可产生一有用信号)。2、如l中所述的方法，其中至少一微载体亚群可为以下中任一种或全体球形、三角形、梯形、立方体、长圆柱体、空心、空心且具有通路开口、管体(密封的或在任一端或沿其长度方向任一处具有一开口)、多孔或平面形状。可沿直接接触细胞培养基的所述复数个形状表面的任一位置进行化学修饰以允许或禁止细胞附着。2b、如上述1和2中所述的方法，其中所述微载体的特征在于具有一可支持细胞生长的表面。2C、如上述1至3中所述的方法，其中所述微载体的特征在于不具有能够支持细胞生长的特定位点。2d、如1禾B2中所述的方法，其中所述微球体具有一介于1nm和1mm间的平均直径。2e.如说明项1至2c中所述的方法，其中所述微载体具有一介于100rnn和500nm间的平均直径。2f、如1至2中所述的方法，其中所述微载体具有一处于0.8至1.4g/cm范围内的细胞培养载体密度，此可使所述用于细胞培养的微载体悬浮于一培养溶液中。2g、如上述1中所述的方法，其中所述微载体通过喷雾聚结和乳液聚合制造。3、如恰于上述1或2中所述的一可分解的生物相容微载体，其允许将细胞递送至一感兴趣位点，并随后用多种方式对该泡进行破碎、瓦解、或溶解。例如，但非一限制性应用，可通过将超声能量传送至体内或体外泡位置而使这些泡破碎。4、一种具有经修饰表面以允许非贴壁依赖细胞附着的微载体。经改造微载体5、一种可向一微载体内部或之上赋予检测分子以测量生长于微载体之上或内部的活细胞中的细胞生长及/或活性的方法。6、一种位于微载体内部或之上的检测分子，其可放大由位于如上述4中的微载体内部或之上的另一检测分子发出的信号。7、一种设计用于贴壁依赖细胞的生长及/或维持的微载体，其纳入有可赋予一磁性偶极子的材料，或其中所述微载体具有磁性(包含铁或铁氧化物)、或顺磁性、或其中所述微载体具有一这些特性的组合。8、一种设计用于贴壁依赖细胞的生长及/或维持的微载体，其使用可赋予一控制微载体密度及/或浮力的能力的材料制造，或包含可使所述微载体密度或浮力受外力控制的材料。9、一种在任一说明项中阐述的设计用于贴壁依赖细胞生长及/或维持的微载体，其纳入有可赋予透明性和较感兴趣细胞中固有的自发荧光为低的自发荧光的材料。经改造微载体的应用10、已经改造为可模拟生物学过程的分析工具的微载体。11、如上述8中所述的已经改造以监测和测量细胞迁移、侵入、和转移的微载体。12、如上述7和8中任一项中所述的经改造以模拟多种器官生物学活性的微载体，其中所述器官包括(但不限于)血脑屏障、肠道、肾脏、肝脏、心脏、肺、骨髓、皮肤、和血管。13、微载体可用作干细胞的附着表面，其中这些干细胞取自多种来源，例如(但不限于)脂肪组织、胚胎、和末梢循环。所模拟的微重力环境有利于促进干细胞的维持或分化成子代细胞。物理特性的组合14、具有如说明项1至6中任一项或所有项中所述的特性的组合的微载体。动能15、一种控制一微载体在一液体中的加速度、运动、运动速度、绝对位置、和旋转速度等动能参数的方法。16、一种控制一液体中的微载体内的动能参数的方法。17、一种在一液体中的微载体簇中控制如上述1和2中动能参数的方法。控制可影响微载体的各物理力18、一种控制可影响如上述1至7中任一项或所有项中的微载体的磁力的方法。19、一种通过控制施于包含所述微载体的液体的外部压力来控制如上述1至7中任一项或所有项中的微载体的浮力或动能的方法。20、一种通过引发一热梯度来控制上述1至7中任一项或所有项中的任一微载体以及各微载体的动能参数的方法。控制许多物理力21、如上述1至7中所述的微载体，其包含指示其取向及/或行进方向的物质。21b、如说明项1至7及/或21中的任一项所述的微载体，其参与一反馈回路，其中其动能及/或行进方向及/或取向可在培养容器外部基于其由上述21中所阐述方法确定的取向加以控制。测量微载体取向和细胞生物化学和生理学22、一种用于检测如上述1至7中任一项中的微载体以测定取向、细胞生长、和细胞健康的方法。22b、如上述1中所述的方法，其中至少一个微载体亚群具有一发光、荧光、或比色特性，且其中由所述微载体发出的信号可由任一包括下列的方法检测(a)整体框架成像；(b)部分框架成像；和(c)信号捕获作为一静态记录或信号测量或基于时间的记录或信号测量。23、如上述15中所述的方法，其使用任何可测量由微载体之上或内部的细胞发出的电磁频谱的变化的装置，包括(但不限于)一分光光度计、荧光计、拉曼(Raman)光散射仪、照度计、荧光旋光仪、及/或光散射仪。24、一种检测由微载体发出的细胞生物化学信号的方法[例如，在一溶液中检验微载体以测定药物吸收]。生物反应器24b、一种包含微载体和所述微载体生长于其中的基质的生物反应器。25、一种用于最优化微载体上细胞生长的生物反应器，其由一包含下列的单元构成一容纳细胞培养基的容器、一向微载体培养物供热以保持最优生长和维持温度的装置、一供应恒定气体源(C02、空气、及/或氧气)的装置、一控制如上述8至13中的微载体的动能、位置、取向、和运动的外部控制装置、和保持所述生物反应器内无菌的装置。26、如上述18中所述的生物反应器，但以一模块形式构建以便可同时使用多个生物反应器和共享相同的能源、气体、及/或外部控制装置，并可使基质和微载体保持无菌。27、如上述18和19中所述的生物反应器，其采用一允许通过容器壁给细胞培养基充分充氧的容器，例如一多氟化袋，但不允许明显的水分损失或病毒或细菌的传播。28、如上述18至20中所述的生物反应器，其采用一外部计算装置来控制气体流、温度、湿度、无菌性。自动化29、一种由单一或复数个如上述18至21中所述的生物反应器组成的自动化细胞培养系统。30、如上述21中所述的自动化细胞培养系统，其纳入有一向所述生物反应器中添加基质和自所述生物反应器中取出基质的装置。31、如上述21至22中任一项中所述的自动化细胞培养系统，其纳入有一接受一小瓶培养细胞输入的装置。32、一种自动化装置，其可在解冻所述细胞、打开所述容器并将解冻的细胞转移至如上述18至21中所述的包含细胞培养基的生物反应器中之前对提供于所述自动化细胞培养装置的所述小瓶细胞进行灭菌。33、一自动化装置，其可维持、培养、和监测培养细胞的进程(包括保持无菌性、更换基质)、可维持与微载体有关的最优动能、并可在恰当时间收获细胞。34、如上述26中所述的自动化装置，其包括一计算机系统以根据细胞培养需要监测和调节基于上述21至25中任一项所述的自动化系统的性能。35、一种可制备和冷冻细胞以供长期保存的自动化装置，其使用一受控的冷冻曲线来降低欲冷冻细胞的温度，同时所述细胞仍附着在微载体上。36、一种自动化装置，其可如上述27中所述制备和冷冻细胞，但釆用强磁场来防止所述细胞或微载体中冰的微结晶化。37、一种自动化装置，其可制备细胞以供长期保存，但对所述细胞/微载体复合体实施干燥。38、一种自动化系统，其包含制造所需微载体需要的受一软件算法控制的试剂和硬件。尽管为阐释目的对本发明进行了详细阐述，但应了解，这些详述仅用于阐释目的，并且业内熟练的技术人员可对其中所述内容实施改变且不会脱离本发明的精神和范围。本文所引用所有参考文献的全部内容皆以引用的方式并入本文中。参者文献1.FelderRA^GildeaJ.Automatedcellculturesystemandprocess.USPatent顯88,068,Provisional07.17.03.2.MizrahiA.Biologicalsproducedftomanimalcellsincukure—anoverview,BiotechnolAdv.1诉8;6(2):207-20,3.TalbotP,KeenMJ,UtilizationofDEAE-cdluloseasamicrocaniermaterial.DevBiolStand1邻0;46:147-149.4.JohanssonA,MelsenV.Biosilonanewniicrocarriei".DevBiolStand1980;46:125-129.5.WissemaimKW，JacobsonBS.Puregelatinmicrocarrieirs:synthesisanduseincellattachmentandg>wthoffibroblastandendotheUalcdls.In-VitroCellDeviBiol簡;21:391-柳，6.HuangYM,RorrerGL.Cultivationofraicroplantletsderivedfromthemarinereda!gaAgardhiel，asubu!atainastirredtankphotobioreaetor,BioteehnolProgMar/Apr2003;19(2):418-27.7.KwonJY,PengC.Calcium-alginategelbeadcross-linkedwithgelatinasmicrocarrierforanchorage~dependentcellculture.Biotechniqiies20O2;33:212-218.8.ThillyWG，LevineDW.Microcarrierculture:ahomogeneousenvironmentforstudiesofcellularbiochemistiy.MethodsEnzymol.1979;58:184-1949.VanWezeiAL.Growthofcell-strainsandprimarycdlsonmicro-carriersinhomogeneousculture.Nature1967;216:64-65.10.KoichiK,UmezawaK,FuneriuDP,MyakeM,MiyakeJ,Nag咖uneT.Immo础;sedcultureofnon-adherentcdk<manoleylpoly(ethykneglycol)ether-modifiedsurface.BioTechniques，2003;35(5):1014402L11ZhangSL，ZhangSL,YanL，Al加anM,LassieM，NugentH,FrankclF,LauffcnburgerDA，WhitesidesGM，RichA.Biologicalsurfaceengineering;asimplesystemforcellpatternformation.Biomaterials1卿;20;1213-1220.12,ChenCS,MrksichM,.HuangS,WhitesidesGM,IngherDE.GeometriccontrolofcdlHfeanddeath.Science1997;276:1425，1428.13.ChenCS，MrksichM，HuangS，WhitesidesGM,IngherDE.Micropattemedsurfacesforcontrolofcellshape,position^andftinction.BiotechnolProgl卿;14:356-363,14.OstuniE，YanL,WhitesidesGM.Theinteractionofproteinsandcellswithself-assembledmonolayersofaikane-thiolatesongoldandsilv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微载体。25、根据权利要求24所述的生物反应器，其中所述水凝胶组合物选自由藻酸盐、明胶、聚丙烯酰胺与胶原或明胶的共聚合物、具有改变电荷的聚丙烯酰胺、藻酸盐与明胶的共聚合物及其一组合组成的群组。26、根据权利要求24所述的生物反应器，其中所述水凝胶组合物的所述材料可赋予一种控制所述微载体的密度及/或浮力的能力或使所述微载体的所述密度或浮力受到至少一种物理力的控制。27、根据权利要求24所述的生物反应器，其中所述水凝胶组合物的所述材料可赋予一磁性偶极子，其可为一磁性粒子、一顺磁性粒子、一空气泡、一气体泡、一空心珠子或其一组合。28、根据权利要求24所述的生物反应器，其中所述细胞是人类、哺乳动物、动物或植物细胞。29、根据权利要求24所述的生物反应器，其中所述物理力包括电磁能、声波能、热能、压力、重力或其一组合。30、根据权利要求24所述的生物反应器，其中所述微载体进一步在所述微载体内或其上包括一探测分子以测量在所述微载体内或其上的培养物中生长的所述细胞中的细胞生长及/或活性。31、根据权利要求30所述的生物反应器，其进一步包括一监测系统以检测所述探测分子。32、根据权利要求24所述的生物反应器，其进一步包括一分析系统以分析包含于所述微载体上的所述细胞及其细胞产物。33、根据权利要求33所述的生物反应器，其中所述分析系统通过一可封闭开口直接连接至所述培养容器。34、根据权利要求24所述的生物反应器，其进一步包括一微载体制造系统以生产所述微载体。35、根据权利要求34所述的生物反应器，其中所述微载体制造系统通过一可封闭开口直接连接至所述培养容器。36、根据权利要求34所述的生物反应器，其进一步包括一用以检测一与所述微载体相结合的报道分子的监测系统、一用以分析包含于所述微载体上的所述细胞及其细胞产物的分析系统以及一用以生产所述微载体的微载体制造系统。37、一种自动化生物反应器系统，其包括一个以上根据权利要求24所述的自动化生物反应器。38、根据权利要求37所述的生物反应器系统，其中所述系统包括一用以控制所述生物反应器中每一反应器的功能及所述物理力的产生或控制的单一控制系统以控制所述微载体。39、一种自动化生物反应器系统，其包括一个以上根据权利要求36所述的自动化生物反应器。40、一种使细胞生长的方法，其包括(a)将根据权利要求1所述的微载体添加到一生物反应器中的培养基中；(b)施加物理力或通过重力使所述细胞和微载体聚集到一起；(C)使所述微载体与活细胞保持接触，直到所述活细胞附着到所述微载体上；(d)施加物理力以向所述包含如(C)中的附着细胞的微载体赋予动能；(e)施加物理力使微载体运动以允许使用人工或自动化方法以新鲜培养基更换耗尽的培养基；(f)施加物理力使微载体运动以允许对其进行收集从而将细胞传递至如(a)-(e)中的新培养物中；及/或(f)根据一方法施加物理力使所述微载体运动以收集所述微载体并将其转移至另一培养容器或一分析系统中；41、一种在悬浮液中使细胞生长的方法，其包括(a)向培养基中添加如权利要求8所述禁止细胞附着的微载体；(b)施加物理力或通过重力向所述培养基赋予动能；(c)施加物理力使微载体和细胞运动以允许使用人工或自动化方法以新鲜培养基更换耗尽的培养基；(d)施加物理力使微载体和细胞运动以允许收集所述细胞从而将细胞传递至如权利要求(a)-(c)中的新培养物中；及(e)根据一方法施加物理力使所述微载体运动以收集所述细胞并将其转移至另一容器或一分析方法中。42、一种储存位于根据权利要求1所述的微载体上或其中且在一生物反应器中培养的细胞的方法，所述方法通过冷冻所述微载体或对所述微载体进行脱水来达成，其中所述微载体包含生长于所述微载体上的培养物中的细胞。43、一种重新培养根据权利要求42所述的经储存细胞的方法，所述方法通过解冻或再水合及在一细胞培养系统中进行培养来达成。44、一种储存在一生物反应器中用根据权利要求8所述的微载体培养的细胞的方法，所述方法通过冷冻所述微载体或对所述微载体进行脱水来达成，其中所述微载体包含生长于所述微载体上的培养物中的细胞。45、一种重新培养根据权利要求44所述的经储存细胞的方法，所述方法通过解冻或再水合及在一细胞培养系统中进行培养来达成。全文摘要本发明概言之涉及细胞培养领域，其是一种主要用于细胞生长、增殖和繁殖以供进行分析以及用于产生及收集细胞产物的实验室方法。本发明包括经官能化及/或改造的水凝胶微载体，其可展示下述任何或全部特性可控浮力、铁磁性或顺磁性、分子元件或装配的报道元件及光学透明度。该等微载体可用于一使用外力来控制所述微载体动能及平移或位置方位的生物反应器中以利于细胞生长及/或细胞分析。所述生物反应器可作为一采用下述任何之一或全部的自动化系统的一部分一种微载体制造方法、一种监测方法、一种细胞培养方法及一种分析方法。在所述自动化系统中使用一单一生物反应器或复数个生物反应器能够在最少人类干预下进行细胞培养和分析。文档编号C12NGK101416059SQ200480026441公开日2009年4月22日申请日期2004年7月19日优先权日2003年7月17日发明者约翰·J·吉尔德,罗宾·A·费尔德申请人:格洛伯塞尔解决方案公司