分钟内在它 们的3'端添加 dATP来修饰运些片段。因此，使用所公开的组合物混合物，两个反应共同仅花 费15分钟。
[0化1] 测试被称为端转化主混合物化nd Conversion Master Mix)的所公开的组合物的 一个实施方案。该端转化主混合物包含W下2X浓度和比率的酶、缓冲液和其它必需反应/保 存组分：Iu/山T4多核巧酸激酶;0.3化AU T4DNA聚合酶;0.1化/山Klenow片段，和0.化Ai 1 mod-Tbr DNA聚合酶。反应辅因子和核巧酸是：20mM MgCl2,2mM dATP;0.4mM dCTP;0.4mM dTTP;0.2mM dGTP;2mM ATP。所述端转化主混合物的离子强度和pH可使用IOOmM-IOSmM 化is-HCl(pH 8.3)和20mM至50mM的单价金属盐酸盐(例如化Cl、KCl、LiCl)进行配制。稳定 剂和冷冻保护剂是：20mM X-100;12%(v/v)甘油；0.07%NP 40;0.07% 吐溫 20;和0.024mMEDTA。
[0052]适于在酶共混物中使用的其它盐和稳定剂将对本领域技术人员是显而易见的，且 对于在纯化和/或dA加尾反应中所使用的不同的DNA聚合酶可不同。
[0化3]实施例2
[0054] 缓冲液和聚合酶组合物对纯化、加尾和憐酸化的作用
[0055] 为测试DNA片段3'端加尾效率和分析取决于3'末端核巧酸的潜在的偏性，开发和 使用一种长度和3'末端核巧酸均不同的，并在其5'端用切5标记的四个寡核巧酸双链体的 模型系统（图1)。
[0056] 检查Klenow片段excT突变体的dA加尾能力，并在图2显示，其中泳道(A)是补充有 0.2mM dATP的最佳Klenow片段缓冲液（IOx反应缓冲液，EP0421);泳道(B)是含有ImM DTT和 0.2mM dATP的商业缓冲液G; W及泳道(C)是优化的DNA末端修复缓冲液(快速DNA末端修复 试剂盒K0771)。在37 °C下使用5个单位的酶在50iil的反应混合物(含有如图1所示的切-5标 记的寡核巧酸双链体的7.5pmol当量分子混合物）中执行dA加尾反应。条带对代表有或没有 单一另外的dA的该寡核巧酸双链体。
[0057] 图2显示泳道A-Ix Klenow缓冲液+0.2mM dATP;泳道B-Ix G缓冲液和ImM DTT+ 0.2mM dATP; W及泳道C-IX末端修复缓冲液。
[005引在图2中所陈述的结果提示Klenow片段ex0-，甚至在30分钟的解育后，在全部S种 测试反应混合物中不能均匀地延伸寡核巧酸，相较于那些W3'-末端嚷岭(A/G)为特征的， 更有效地延伸3'-末端喀晚(C/T)。此外，由Klenow片段exo^行的dA加尾在(C)缓冲液中效 率最低，所述(C)缓冲液对于执行DNA片段的纯化和憐酸化的酶最佳，但对于Klenow片段是 次最佳的。
[0059] 检查化q DNA聚合酶的dA加尾能力，并在图3显示，其中泳道(A)是优化的DNA末端 修复缓冲液(pH 7.5);泳道(B)与A中是相同的但抑8.0;W及泳道(C)与A中是相同的但pH 8.3。优化的缓冲液是来自快速DNA末端修复试剂盒K0771的IOX末端修复反应混合物。在60 °C下使用7.5个单位的酶在SOiil反应混合物(含有如图1所示的切-5标记的寡核巧酸双链体 的7.5pmol当量分子混合物）中执行反应。
[0060] 图3A-1X末端修复缓冲液，pH 7.5;B-lx末端修复缓冲液，pH 8.0;c-lx末端修复缓 冲液抑8.3。
[0061] 在图3中所陈述的结果提示Taq DNA聚合酶在抑7.5下优选3'末端喀晚的延伸，其 对于纯化和憐酸化反应最佳。抑值从抑7.5至pH 8.3的增加对于化q DNA聚合酶dA加尾效 率和均匀性具有积极的作用。然而，甚至在20分钟的解育后，相较于本实验所使用的其它底 物，具有3 '末端G的寡核巧酸被延伸的效率较低。
[0062] 用mod-化r DNA聚合酶(exo-)优化反应条件实验掲示酶如化q聚合酶对于dA加尾 优选增加的pH，但显示对有3'末端C或T的DNA片段的偏好较低(见图4)。为确保dA加尾效率 更高，使反应混合物富集dATP，将其浓度增加至ImM。为模拟当各种量的DNA片段必须被纯化 和dA加尾的情形，用恒定量巧个单位)的mod-化r DNA聚合酶在优化的缓冲液(来自快速DNA 末端修复试剂盒K0771的IOX末端修复反应混合物）中在pH 8.3使用增加的dATP浓度（ImM) 和不同量的如图1所示的寡核巧酸双链体进行该实验。
[0063] 图4显示泳道A 1.5pmol双链寡核巧酸的混合物；泳道B 7.5pmol双链寡核巧酸的 混合物;泳道C ISpmol双链寡核巧酸的混合物;泳道D 22.5pmol双链寡核巧酸的混合物；W 及泳道E 30pmol双链寡核巧酸的混合物。在60°C下在50iil反应混合物中执行反应10分钟。
[0064] 在图4中所陈述的结果4显示mod-化r DNA聚合酶有效地且均匀地在大范围浓度的 测试底物中延伸全部类型的DNA末端，因此胜过Klenow片段ex〇-酶和化q DNA聚合酶。
[0065] 对照DNA片段用于在一个反应混合物中测试DNA末端修复和DM3'端加尾的效率。 该DNA片段是26化P，具有3 '和5 '末端突出端，并在其5 '端缺乏憐酸，且通过PsuI和PstI裂解 和随后的碱性憐酸酶的处理来生成。当单个DNA片段可含有3 '和/或5 '突出端并缺乏5 '末端 憐酸时，该DNA底物模拟DNA物理剪切后的情形。
[0066] Iiig的DM片段在50iil反应混合物中与商业末端修复酶混合物（Thermo Scientific，K0771)和5单位的嗜热DNA聚合酶= Hiod-IlDr DNA聚合酶或hq DNA聚合酶解育。 在20°C解育反应混合物5分钟，此允许末端修复酶纯化和憐酸化DNA片段末端，接着在72°C 解育10分钟，该条件有利于嗜溫末端修复酶和由嗜热DNA聚合酶进行的DNA 3'端加尾同时 失活。在该步骤后，长度为60bp，并携带3 '末端dT延伸的DNA接头，被添加到反应混合物至最 终浓度为化M。在22°C下使用T4DNA连接酶5分钟完成将该DNA接头连接到DNA片段，且降所得 的反应产物在1%琼脂糖凝胶上进行分析。在图5中显示该实验方案。在图6中显示结果，其 中D巧邮2是使用mod-化r DNA聚合酶所制备的样本;11和T2是使用化q DNA聚合酶所制备的 样本;F代表对照DNA片段;L是O'RangeRuler 50bp DNA阶梯(Thermo Scientific，SM0613); A是有连接到DNA片段的两端的接头的38化P反应产物(60+261+60bp); W及B是有连接到DNA 片段一端的接头的32化P反应产物(261+6化P)。
[0067] 图6显示泳道Dl、D2-使用DyNAmoIVDNA聚合酶制备的样本；泳道Tl、T2-使用Taq DNA聚合酶制备的样本;F-对照DNA片段;A显示有连接到DNA片段的两端的接头的38化P反应 产物(60+261+60bp) ;B显示有连接到DNA片段一端的接头的32化P反应产物（261+60bp) 0'RangeRuIer 50bp DNA阶梯（Thermo Scientific,SM0613)。
[006引在图6中所陈述的结果显示mod-Tbr DNA聚合酶生成更多正确结构的产物（片段 A)，表明该酶胜过化q DNA聚合酶，且更适合于在一种反应混合物内与DNA末端修复酶使用。 只有纯化的和然后dA加尾的对照DNA片段可被连接到含有dT的接头。主导的最大的条带A代 表有两端连接接头的DNA片段，而只有一小部分的对照DNA片段F未经处理。
[0069] 运些数据表明当在单一反应混合物中使用不同的热稳定DM聚合酶进行时，DNA末 端修复和DM3'端dA加尾反应的效率不同，且进一步，包含mocKTbr的本发明的反应混合物 在效率上胜过W前用于所述反应的其它组合物。此外，值得注意的是，当使用发明的组合物 时，没有更大DNA片段的痕迹，该更大的DNA片段可在然后可连接在一起的纯化的DNA片段的 未完全dA加尾的情况下出现。
[0070] 实施例3
[0071 ] 2x浓缩末端转化主混合物的稳定性
[0072] 对于稳定性测试，如公开的2x末端转化主混合物被保存在-20°C和+25°C(W代表 加速的稳定性测试)不同的时间段。使用在图5中所示的相同的实验方案执行稳定性测试。 将化g对照DNA片段在已经在-20°C保存的Ix末端转化主混合物的SOiil反应混合物中解育 Smin，从而允许末端修复酶纯化和憐酸化DNA末端，接着在72 °C下解育10分钟，该条件有利 于嗜溫DNA末端修复酶和由mod-化r DNA聚合酶进行的DNA 3 '