4(玉蜀泰）；F;romm等人（1990)Biotechnology 8:833 839(玉蜀泰）；Hooykaas-Van Slogteren等人，（1984)化 1:ure(X〇ndon)3ll :763-764; 美国专利5，736，369(谷类）；Bytebier等人（1987)Proc.化tl .Acad. Sci .USA84:5:345-5349 (百合科）；De Wet等人（1985) ,The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, 化apman等人编辑(X〇ngman，New 化rk)，第 197-209页（花粉）Jaeppler等人（1990)Plant Cell R巧Orts 9:415-418;和Kaeppler等人（Iggs)Ilieor-Appl.Genet.84:560-566(晶须介 导的转化）；〇'化Iluin等人（1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔）；Li等人（1993)Plant Cell Reports 12:250-255，W及化ristou和!^rd(Iggs)Annals of Botany 75:407-413 (稻）；〇sjoda 等人（ 1996)Nature Biotechnology 14:745-750(通过根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)转化玉蜀泰）；所有运些文献与专利均W引用方式并入本 文。
[0103] 在特定实施方案中，可使用多种瞬时转化方法将包含本公开的调控元件序列的 DNA构建体提供给植物。运类瞬时转化方法包括但不限于病毒载体系统，和W阻止DNA后续 释放的方式沉淀多核巧酸。因此，虽然仍可能从粒子结合的DNA开始转录，但运种DNA释出继 而整合到基因组中的频率会大大降低。此类方法包括使用涂覆聚乙基亚胺的粒子(PEI; Sigma-Al 化 ich?#P3143)。
[0104] 在其他实施方案中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触，来将本公开的多核巧 酸引入植物。通常，运类方法设及将本公开的核巧酸构建体渗入病毒DNA或RNA分子内。设及 病毒DNA或RNA分子的用于将多核巧酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本 领域已知的。参见例如美国专利 5,889，191、5,889，190、5,866,785、5,589,367、5,316,931， W及化Ka等人（1996)Molecular Biotechnology 5:209-221;运些专利和文献均W引用方 式并入本文。
[0105] 用于在植物基因组中特定位置处祀向插入多核巧酸的方法是本领域已知的。在一 个实施方案中，在期望的基因组位置插入多核巧酸是使用位点特异性重组系统实现的。参 见例如 W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855 和 W099/25853,运些专利全部 W 引用方式并入本文。简言之，可W在转移盒中包含本公开的多核巧酸，所述转移盒侧接两个 不相同的重组位点。将转移盒引入植物，该植物的基因组中稳定渗入了祀位点，其中所述祀 位点侧接两个与该转移盒的所述位点相对应的不相同重组位点。提供适当的重组酶，将转 移盒整合在该祀标位点处。感兴趣的多核巧酸因而被整合在植物基因组中的特定染色体位 置处。
[0106] 可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如McCormick等人（1986) Plant Cell Reports 5:81-84。然后可W培育运些植株，用相同的转化株系或者不同的株 系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交体。可W培育两代或更多代 植株，确保所需表型特征的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子，确保已实现所需表型 特征的表达。W此方式，本公开提供了基因组中稳定渗入了本公开的核巧酸构建体(例如本 公开的表达盒）的转化种子(也称为"转基因种子"）。
[0107] 本文所用的冠词"一个"和"一种"指一个（种）或多于一个（种）（即，指至少一个 (种））所述冠词的语法对象。举例而言，"一个要素"意指一个或多个要素。
[0108] 在本说明书通篇中，词语"包含"及其变体(诸如"包括"或"含有"）应被理解为暗示 包括规定的要素、整数或步骤或者要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其他要素、整数 或步骤或者要素组、整数组或步骤组。
[0109] 提供下列实施例是为了举例说明本公开且并非用于限制本公开的范围。
[0110] 纖
[0111] 实施例1:碧冬茄脉明病毒调控元件序列
[0112] SEQ ID NO: 2示出的调控元件是通过在GenBank Genomes中检索已测序并归属于 花挪菜病毒科病毒家族的病毒基因组获得的。该检索基于公知的花挪菜花叶病毒35S (CaMV35S)启动子而开始。所述启动子驱动异源基因在大多数植物的大多数组织中的组成 型表达。来自该病毒家族的其他调控元件(诸如玄参花叶病毒34S启动子)也在植物中引导 组成型样表达。因此，源自花挪菜病毒科病毒家族的另外的调控元件也可W在植物中驱动 组成型表达。花挪菜病毒科基因组的结构相当保守（图1)。该基因组的存在于所谓长基因间 区域化IR)中的区域通常含有为使启动子在植物中起作用而必需的调控序列。
[0113] 碧冬茄脉明病毒(PVCV)基因组具有LIR，因此W该区域为祀标进行功能启动子分 析。选择两个含有LIR的序列在植物中测试。最长的序列由1049bp组成（WSEQ ID N0:2示 出），并在该序列的3'端上游65bp处具有推定的TATA框。整个1049bp序列被称为PVCV全长启 动子(PVCV FL)。
[0114] 第二个序列是该全长启动子的截短版本(参见图2和SEQ ID NO: 1)。它被称作PVCV TR启动子，长369bp，由该全长启动子的3 '端组成。通过缺失掉该全长启动子5/端的680bp， 由该截短启动子在植物中引导的表达模式可发生改变，从而提供对该调控区中的重要调控 元件的认识。
[0115] 重复调控元件区域也可改变表达模式，如果存在转录增强子的话，甚至可W增强 由启动子引导的表达。现已证实重复CaMV35S启动子的上游区域可使表达增加大约十倍 化ay,R.等人，（1987)Science 236:1299-1302)。为确定重复对PVCV TR调控元件造成的影 响，我们将28化P截短调控元件置于369bp序列上游，产生在推定的TATA框上游具有重复的 280bp区段的调控元件(PVCV Dup;SEQ ID N0:3,图4)。所有3个启动子序列都用合成法制备 W供克隆到表达载体中。
[01W 实施例2:使用报道基因分析表达
[0117] 将PVCV FL(沈Q ID N0:2)调控元件、PVCV TR(沈Q ID NO: 1)调控元件和PVCV Dup (SEQ ID NO: 3)调控元件在表达载体中，与/不与Adhl内含子1 一起可操作地连接至B-葡糖 醒酸酶(GUS)基因，来测试合成的DNA片段是否会引导表达。将A化1内含子包括在内的目的 是提高表达，因为已证实在谷类植物细胞中，存在一些5/近端内含子可增强转基因表达(参 见化Ilis等人（1987)Genes and Development l:1183-1200;Kyoz址a等人（1990)Maydica 35:353-357)O
[0118] 在分析PVCV启动子时，使用来自玉蜀泰的师i-1启动子(使用其本身的内含子)作 为阳性对照。还将其可操作地连接至B-葡糖醒酸酶(GUS)基因，运样，便可使用该启动子来 比较巧巾PVCV启动子的表达模式和表达水平。Ubi-I启动子在玉蜀泰的大多数组织中是强组 成型启动子。
[0119] 使用农杆菌方案产生稳定转化的植株(实施例3中详述）。对每个调控元件和调控 元件X内含子的组合，再生出十棵植株。使各植株在溫室条件下生长，直到它们达到V4至V6 的生长阶段。由植株上的围绕叶（collared leaves)数目确定营养生长期。因此，V6期的植 株有6片完全围绕的叶子。从处于运个时期的每棵植株采集叶和根组织样品。然后让各植株 生长至早期Rl阶段，运是正好在花粉散出之前的时间，此时收集须和茎杆(节和节间）W及 穗组织。最终，在植株开始散播花粉时收集花粉。使用组织化学染色、定量巧光测定和qRT-PCR的组合检查所述3个调控元件引导的表达模式和表达水平。
[0120] PVCV调控元件驱动茎、根、叶、穗和巧粒组织中的表达(表1和表2)。有AD化内含子 的茎中的表达水平最高。存在该内含子，通常也有利于根和穗中的表达。未在须中观察到表 达，基本上也未在花粉中检测到表达。
[0。1] 表1:PVCV调控元件(无 AdhI内含子I)在植物中表达的结果 [0122]
[0123] 数据W0-6标度表示，其中玉蜀泰化i-1启动子代表中值。
[0124] 表2: PVCV调控元件(有Adh 1内含子1)在植物中表达的结果 [01951
[01%]数据W0-6标度表示，其中玉蜀泰化i-1启动子代表中间值。
[0127] 实施例3:农杆菌介导的玉蜀泰转化及转基因植物再生
[0128] 为了用本公开的调控元件序列进行农杆菌介导的玉蜀泰转化，采用了 Zhao提出的 方法(参见美国专利5,981，840和口〇'专利公布胖098/32326;运两份专利的内容据此^引用 方式并入本文）。简言之，从玉蜀泰分离出未成熟胚，然后取运些未成熟胚在特定条件下接 触农杆菌悬液，借此细菌能够将调控元件序列转移到至少一个未成熟胚的至少一个细胞中 (步骤1:感染步骤）。在该步骤中，将未成熟胚浸泡在农杆菌悬液中，引发接种。使胚与农杆 菌共培养一段时间（步骤2:共培养步骤）。在该感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上 进行培养。在该共培养期之后，进行任选的"静息"步骤。在运个静息步骤中，将胚在至少一 种已知抑制农杆菌生长的抗生素存在下进行溫育，不添加植物转化体的选择剂(步骤3:静 息步骤）。接着，在含有选择剂的培养基上培养接种的胚，并且回收生长的转化愈伤组织(步 骤4:选择步骤）。将未成熟胚置于含选择剂的固体培养基上培养，使转化细胞选择性生长。 然后使愈伤组织再生成植株(步骤5:再生步骤），并且在固体培养基上培养在选择性培养基 上培育的愈伤组织W便再生植株。
[0129] 实施例4:使用报道基因分析大豆中的表达
[0130] 将PVCV化调控元件可操作地连接至两个不同的杀昆虫基因 Prm20和Prm21，测试 其是否会在大豆植株中引导表达。使用生物射弹轰击方法产生了稳定转化的植株。使用 qPCR筛选潮霉素抗性TO植株中插入表达盒的情况。通过昆虫功效测试评估PVCV引导的表达 水平。用摄食性昆虫侵染植株提供对蛋白质表达情况的快速评估，因为需要充分的水平W 保护植株免于昆虫侵害。若表达不充分，会导致植株被摄食，继而毁损。除昆虫功效测试外， 我们还测定了两个TO事件中单拷贝Tl植株表达PRM21的水平。表3中的结果显示出PVCV调控 元件在转基因 TO和Tl大豆植株的叶子中发挥作用，并能够W保护植株，使其免遭绒毛豆毛
[0132] 虫(VBC)和大豆尺暧(S化)影响的水平引导表达。[0131 ] 車q.Pv^v^闻歧击化左^r百出於^Tf^方 fr?^車 h?主里
[0133]
[0134] 功效值W保护叶子免遭摄食达>90%的事件百分比表示
[0135] 表达W两个TO事件中单拷贝Tl植株的平均ppm表示;其他TO事件中的多拷贝Tl植 株的表达范围为0至81化pm。
[0136] CTP =叶绿体转运肤
[0137] N/D =未测定
[013引实施例5:转基因大豆植株的转化和再生 [0。9]培养条件
[0140]将大豆胚发生悬浮培养物（CV Jack)在15化pm、26 °C的旋转摇荡器上保持在35mL 液体培养基SB196(参见下文配方）中，该旋转摇荡器具有冷白色巧光灯，光周期为16:8小时 白天/黑夜，光强度为60-8扣E/m2/s。每7天至两周，通过将大约35mg的组织接种到35ml的新 鲜液体SB196中，对培养物进行分培(优选的分培间隔为每7天）。
[0141] W下实施例描述大豆胚发生悬浮培养物通过粒子枪轰击方法与质粒和DNA片段一 起转化化 Iein 等人（1987)NaUire ,327:70)。
[01创引发大豆胚发生悬浮培养物
[0143] 每月两次对大豆培养物进行引发，每次引发之间间隔5-7天。
[0144] 在种植45至55天后从可用的大豆植株挑取带有不成熟种子的豆芙，剥壳并放入无 菌绛红色盒子中。将大豆种子在含有1滴象牙皂的5%Clorox溶液(95ml的高压灭菌蒸馈水 加5ml Clorox和1滴皂）中振摇15分钟，对其进行灭菌。用两个1升瓶子的无菌蒸馈水清洗种 子，并且使用小于4mm的种子。切开每颗种子的小的一端，将子叶压出种皮，并且放在SB199 培养基的平板上。两周后，将子叶转移到含有SBl培养基的平板(每个平板25至30个子叶）。 用纤维带包住平板。两至=周后，切取次生胚，并且放入SB196液体培养基中培养10天。
[0145] 用于轰击的DNA的制备
[0146] 将含有感兴趣的基因和选择性标记基因的完整质粒或者DNA质粒片段用于轰击。 使用Promega?方案与应用指南，第二版（第106页）中描述的方法，或者使用QlAGEN' 6 Maxiprep试剂盒或QIAprepSpin miniprep试剂盒，例行制备并纯化用于轰击的质粒 DNA。
[0147] 在每种情况下，将IOiig质粒DNA放入15化L适用于感兴趣的片段的特定酶混合物中 消化。将所得的DNA片段放在1%超纯琼脂糖（Invitrogen?)上进行凝胶电泳分离，从琼脂糖 凝胶切取编码感兴趣的基因的DNA片段。使用;胶提取试剂盒，按照生产商的 方案从琼脂糖纯化DNA。
[0148] 将含有3mg金粒子(3mg金）的50化无菌蒸馈水等分试样加到扣L的化g/化DNA溶液 (完整质粒或者如上所述制备的DNA片段）、50化2.5M化C12和20化的0.1 M亚精胺。将混合物 在满旋摇荡器的水平3上振摇3分钟，并且在台式微量离屯、机中离屯、10秒钟。用4(K)山100% 乙醇洗涂后，通过在40iil 100%乙醇中进行超声处理使沉淀悬浮。向Biolistic PDS1000 / 肥仪器盘的每个飞碟(flying disk)分配扣L DNA悬液。每个扣1等分试样含有大约0.375mg 金/次轰击(即每碟）。
[0149] 组织制备和用DNA轰击
[0150] 取大约150-200mg的7天龄胚悬浮培养物放在空的无菌60 X 15mm平皿中，并且用塑 料网盖住平皿。每板的组织轰击1或2次，膜破裂压力设定为1100PSI，并且腔室抽真空至27-28英寸隶柱。将组织放在离阻滞网/停止网大约3.5英寸处。
[0巧1] 选择转化胚
[0152]用潮霉素(使用憐酸转移酶HPT基因作为选择性标记时)或氯横隆(使用乙酷乳酸 合酶ALS基因作为选择性标记时)选择转化胚。
[。巧引潮霉素(HPT)选择
[0154]在轰击后，将组织放入新鲜的SB196培养基中，如上所述进行培养。轰击后六天，将 该SB196用含有30mg/L潮霉素选择剂的新鲜SB196更换。每周更换一次选择培养基。选择后 四至六周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生簇中生长出来。移取分离的绿 色组织，并且接种到多孔板中，W产生新的克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。
[01巧]氯横隆(ALS)选择
[0156] 在轰击后，将组织在2个含有新鲜SB196培养基的烧瓶之间分配，并且如上所述进 行培养。轰击后六至屯天，将该SB196用含有10化g/ml氯横隆选择剂的新鲜SB196更换。每周 更换一次选择培养基。选择后四至六周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生 簇中生长出来。移取分离的绿色组织，并且接种到含有SB196的多孔板中，W产生新的克隆 繁殖的转化胚发生悬浮培养物。
[0157]