植物调控元件和其用图

植物调控元件和其用图
【专利说明】植物调控元件和其用途
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求2013年3月14日提交的美国临时序列号61/785, 268的权益，所述申 请以引用的方式整体并入本文。
[0003] 序列表的并入
[0004] 名称为"M0NS332W0.txt"的文件中含有的序列表通过电子方式提交来与本文一起 提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表是52. 7千字节（在MicrosoftWindows? 中测量的大小）并且创建于2014年3月11日。 发明领域
[0005] 本发明涉及植物分子生物学、植物遗传工程和适用于调节植物中的基因表达的 DNA分子的领域。
【背景技术】
[0006] 调控元件是通过调节可操作连接可转录DNA分子的转录来调控基因活性的遗传 元件。这类元件可包括启动子、前导区、内含子和3'未翻译区域并且适用于植物分子生物 学和植物遗传工程领域。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供用于包含调控元件的植物和构建体中的新颖调控元件。本发明还提供 包含调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。在本文公开的一个实施方案中，调控元件可 操作地连接至可转录DNA分子。在某些实施方案中，可转录DNA分子相对于调控序列是异源 的。本文还提供制造和使用本文公开的调控元件的方法，包括包含调控元件的构建体，和包 含可操作地连接至相对于调控元件异源的可转录DNA分子的调控元件的转基因植物细胞、 植物和种子。
[0009] 因此，在一方面，本发明提供包含选自由以下组成的组的DNA序列的重组DNA分 子：（a)具有与SEQIDN0 :1-37中任何一个至少约85%序列同一性的DNA序列；(b)包含 SEQIDN0:1-37中任何一个的DNA序列；和（c)SEQIDN0:1-37中任何一个的片段，其中 所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。"异 源可转录DNA分子"是指所述可转录DNA分子相对于其可操作地连接的所述DNA序列为异 源的。在具体实施方案中，重组DNA分子包含与SEQIDN0:l-37中任何一个的DNA序列具 有至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、 至少98 %或至少99 %序列同一性的DNA序列。在具体实施方案中，异源可转录DNA分子包 含具有农艺学重要性的基因，如能够在植物中提供除草剂抗性或害虫抗性的基因。在其他 实施方案中，本发明提供包含如本文提供的重组DNA分子的构建体。
[0010] 在另一方面，本文提供转基因植物细胞，其包括包含选自由以下组成的组的DNA 序列的重组DNA分子：（a)具有与SEQIDN0 :1-37中任何一个至少约85%序列同一性的 DNA序列；（b)包含SEQIDN0 :1-37中任何一个的DNA序列；和（c)SEQIDN0 :1-37中任 何一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源 可转录DNA分子。在某些实施方案中，转基因植物细胞是单子叶植物细胞。在其他实施方 案中，转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
[0011] 在仍然另一个方面，本文进一步提供转基因植物或其部分，其包括包含选自由以 下组成的组的DNA序列的重组DNA分子：（a)具有与SEQIDN0 :1-37中任何一个至少85% 序列同一性的DNA序列；（b)包含SEQIDN0 :1-37中任何一个的DNA序列；和（c)SEQID NO:1-37中任何一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地 连接至异源可转录DNA分子。在具体实施方案中，转基因植物是相对于起始转基因植物的 任何世代的子代植物并且包含重组DNA分子。本文还提供包含在生长时产生这类转基因植 物的重组DNA分子的转基因种子。
[0012] 在另一方面，本发明提供产生商品产品的方法，其包括获得含有本发明的重组DNA 分子的转基因植物或其部分并且从其中产生所述商品产品。在一个实施方案中，商品产品 是加工种子、颗粒、植物部分和粗粉。
[0013] 在仍然另一个方面，本发明提供产生包含本发明的重组DNA分子的转基因植物的 方法，其包括用本发明的重组DNA分子来转化植物细胞以产生转化植物细胞并且使转基因 植物从所述转化植物细胞再生。
【附图说明】
[0014] 图1 :展示本发明的表达盒配置。
[0015] 序列简述
[0016]SEQIDN0 :1-30、38-41、49 和 56 是 3'UTR序列。
[0017] SEQ ID N0 :31、35、42、47、48、50、51、52、53、54和55是调控表达元件组伍乂?）的 DNA序列，其包含5'可操作地连接至前导序列的启动子序列，所述前导序列5'可操作地 连接至内含子序列；或5'可操作地连接至前导序列的启动子序列。
[0018]SEQIDN0:32、36 和 43 是启动子序列。
[0019]SEQIDN0 :33 和 37 是前导序列。
[0020] SEQIDN0 :34是内含子序列。
[0021] SEQIDN0 :44是具有可加工内含子的0 -葡糖醛酸酶（⑶S)的编码序列。
[0022] SEQIDN0 :45和46是荧光素酶编码序列。
[0023] 发明详述
[0024] 本发明提供在植物中具有基因调控活性的DNA分子。这些DNA分子的核苷酸序列 提供为SEQIDN0 :1-37。这些DNA分子能够影响植物组织中的可操作地连接可转录DNA分 子的表达，并且因此调控转基因植物中的可操作地连接转基因的基因表达。本发明还提供 修饰、产生和使用这些分子的方法。本发明还提供包括含有本发明的重组DNA分子的转基 因植物细胞、植物、植物部分和种子的组合物，和制备和使用所述组合物的方法。
[0025] 提供以下定义和方法是为了更好地界定本发明以及指导本发明的一般技术人员 实践本发明。除非另外指出，否则术语应按照相关技术领域的普通技术人员的常规用法来 理解。
[0026] DNA 分子
[0027] 如本文使用，术语"DNA"或"DNA分子"是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即， 脱氧核苷酸碱基的聚合物。如本文使用，术语"DNA序列"是指DNA分子的核苷酸序列。本 文使用的命名法对应于美国联邦法规§ 1.822的标题37,并且在WIP0标准ST. 25(1998)， 附录2,表1和3的表中阐明。
[0028] 如本文使用，"重组DNA分子"是包含在没有人为干预的情况下完全不会自然出现 的组合DNA分子的DNA分子。例如，重组DNA分子可为包含相对于彼此异源的至少两个DNA 分子的DNA分子，包含与在自然界中存在的DNA序列有偏差的DNA序列的DNA分子，或通过 遗传转化并入宿主细胞的DNA中的DNA分子。
[0029] 如本文使用，术语"序列同一性"是指两个最佳比对DNA序列相同的程度。最优序 列比对通过手动地比对两个序列，例如，参考序列和另一个DNA序列，以在具有适当内部核 苷酸插入、缺失或间隙的序列比对中最大限度地提高核苷酸匹配的数目来建立。如本文使 用，术语"参考序列"是指提供为SEQIDN0 :1-37的DNA序列。
[0030] 如本文使用，术语"％序列同一性"或" ％同一性"是同一性分率乘以100。与参 考序列最佳比对的DNA序列的"同一性分率"是最优比对中的核苷酸匹配的数目，除以参考 序列中的核苷酸的总数，例如，整个参考序列的全长中的核苷酸的总数。因此，本发明的一 个实施方案提供包含DNA序列的DNA分子，所述DNA序列在与本文提供为SEQIDN0 :1-37 的参考序列最佳比对时，与参考序列具有至少约85%同一性、至少约86%同一性、至少约 87%同一 ,性、至少约88%同一,性至少约89%同一,性、至少约90 %同一,性、至少约91 %同一 性、至少约92 %同一,性、至少约93%同一,性、至少约94 %同一,性、至少约95%同一,性、至少 约96 %同一,性、至少约97 %同一,性、至少约98 %同一,性、至少约99 %同一,性或至少约100 % 同一性。
[0031] 调控元件
[0032] 调控元件如启动子、前导区、增强子、内含子和转录终止区域（或3' UTR)在活细 胞中的总体基因表达中起整体作用。如本文使用，术语"调控元件"是指具有基因调控活性 的DNA分子。如本文使用，术语"基因调控活性"是指例如通过影响可操作地连接可转录DNA 分子的转录和/或翻译来影响可操作地连接可转录DNA分子的表达的能力。因此，在植物 中起作用的调控元件，如启动子、前导区、增强子、内含子和3' UTR适用于经由遗传工程来 修饰植物表现型。
[0033] 如本文使用，"调控表达元件组"或"EXP"序列可指可操作地连接调控元件，如增强 子、启动子、前导区和内含子的群组。因此，调控表达元件组可包含例如5'可操作地连接至 前导序列的启动子，所述前导序列进而5'可操作地连接至内含子序列。
[0034] 调控元件可通过其基因表达模式来表征，例如，正性和/或负性效应如组成性、时 间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达，和其任何组合，以及 定量或定性指示。如本文使用，"基因表达模式"是将可操作地连接DNA分子转录至转录RNA 分子中的任何模式。转录RNA分子可翻译来产生蛋白质分子或可提供反义或其他调控RNA 分子，如双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小分子RNA(miRNA)等。
[0035] 如本文使用，术语"蛋白质表达"是转录RNA分子翻译至蛋白质分子中的任何模 式。蛋白质表达可通过其时间、空间、发育或形态性质，以及通过定量或定性指示来表征。
[0036] 启动子适用作调节可操作地连接可转录DNA分子的表达的调控元件。如本文使 用，术语"启动子"总体上是指涉及识别和结合RNA聚合酶II和其他蛋白质，如反式作用转 录因子，以启始转录的DNA分子。启动子可最初从基因的5'未翻译区域（5'UTR)识别。 或者，启动子可为合成产生或操纵的DNA分子。启动子还可为嵌合的。嵌合启动子经由两 个或更多个异源DNA分子的融合来产生。适用于实施本发明的启动子包括SEQIDNO:32 和36,包括片段或其变体。在本发明的具体实施方案中，如本文描述的要求保护的DNA分子 和其任何变体或衍生物，进一步定义为包含启动子活性，即，能够充当启动子宿主细胞，如 在转基因植物中。在更进一步特异性实施方案中，片段可定义为展现其源自的起始启动子 分子所具有的启动子活性，或片段可包含"最小启动子"，其提供基础水平转录并且由用于 识别和结合RNA聚合酶II复合物以便启始转录的TATA盒或等效DNA序列组成。
[0037] 在一个实施方案中，提供本文公开的启动子序列的片段。启动子片段可包括启动 子活性，如上所述，并且可单独或与其他启动子和启动子片段组合使用，如在构建嵌合启动 子中，或与其他EXP和EXP片段组合。在具体实施方案中，提供启动子的片段，其包含本文 公开的具有启动子活性的DNA分子的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约 125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、 至少约500、至少约600、至少约700、至少约750、至少约800、至少约900或至少约1000个 邻接核苷酸，或更长。从起始启动子分子产生这类片段的方法在本领域中是熟知的。
[0038] 来自表示为SEQIDN0 :32和36的任何启动子的组合物，如内部或5'缺失，例如， 可使用本领域中熟知方法来产生以改进或改变表达，包括移除对于表达具有正性或负性效 应的元件；复制对于表达具有正性或负性效应的元件；和/或复制或移除对于表达具有组 织或细胞特异性效应的元件。从表示为SEQIDN0 :32和36的任何启动子产生的包含其中 TATA盒元件或其等效序列和下游序列得以移除的3'缺失的组合物可用于例如制得增强 子元件。可产生进一步缺失以移除对于表达具有正性或负性；组织特异性；细胞特异性；或 定时特异性（诸如但不限于，昼夜节律）效应的任何元件。表示为SEQIDN0 :32和36的 任何启动子和从其中衍生的片段或增强子可用于制得嵌合转录调控元件组合物。
[0039] 根据本发明，启动子或启动子片段可针对已知启动子元件，S卩，DNA序列特性，如 TATA盒和其他已知转录因子结合位点基元的存在来分析。这类已知启动子元件的识别可由 本领域技术人员用于设计具有与原始启动子类似表达模式的启动子的变体。
[0040] 如本文使用，术语"前导区"是指从基因的未翻译5'区域（5'UTR)识别的DNA分 子并且总体上定义为转录起始位点（TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸节段。 或者，前导区可为合成产生或操纵DNA元件。前导区可用作调节可操作地连接可转录DNA 分子的表达的5'调控元件。前导区分子可与异源启动子或与其原生启动子一起使用。适 用于实施本发明的前导区包括SEQIDN0 :33和37或片段或其变体。在具体实施方案中， 这类DNA序列可定义为能够在宿主细胞，包括例如转基因植物细胞中充当前导区。在一个 实施方案中，这类DNA序列可解码为包含前导区活性。
[0041] 表示为SEQIDN0 :33和37的前导序列可包含调控元件或可采用可对于可操作地 连接可转录DNA分子之转录或翻译具有效应的次级结构。表示为SEQIDN0 :33和37的前 导序列可根据本发明用于制得影响可操作地连接DNA分子之转录或翻译的嵌合调控元件。
[0042] 如本文使用，术语"内含子"是指DNA分子可从基因识别并且可总体上定义为在翻 译之前的信使RNA(mRNA)处理期间剪接的区域。或者，内含子可为合成产生或操纵DNA元 件。内含子可含有实现可操作地连接基因的转录的增强子元件。内含子可用作调节可操作 地连接可转录DNA分子的表达的调控元件。构建体可包括内含子，并且内含子可或可不相 对于可转录DNA分子异源。在本领域中的内含子的实例包括水稻肌动蛋白内含子和玉米 HSP70内含子。
[0043] 在植物中，在基因构建体中包含一些内含子导致相对于缺乏内含子的构建体， mRNA和蛋白质积聚增加。此效应被称为基因表达的"内含子介导增强" (ME)。已知刺激植 物中的表达的内含子已经在玉米基因（例如，tubAl、Adhl、Shi和Ubil)、水稻基因（例如， tpi)和双子叶植物基因如来自矮牵牛花的那些基因（例如，rbcS)、马铃薯（例如，st-lsl) 和拟南芥（例如，ubq3和patl)中识别。已经证明内含子的剪接位点内的缺失或突变减少 基因表达，指示剪接可能为ME所需要。然而，双子叶植物中的頂E已经通过来自拟南芥的 patl基因的剪接位点内的点突变来证明。相同内含子在一种植物中的多次使用在某些情况 下证明为展现缺点。在那些情况下，需要具有基本控制元件之集合来构建适当重组DNA元 件。
[0044] 适用于实施本发明的内含子包括SEQIDN0:34。来自表示为SEQIDN0:34的内 含子的组合物可包含顺式调控元件的内部缺失或复制；且/或包含内含子/外显子剪接接 合点的5'和3'DNA序列的改变在可操作地连接至启动子+前导区或嵌合启动子+前导 区和编码序列时可用于改进表达或表达特异性。当修饰内含子/外显子界限序列时，避免 使用正好在剪接位点（GT)的5'末端之前的核苷酸序列AT或核苷酸A和相应地正好在剪 接位点（AG)的3'末端之后的核苷酸G或核苷酸序列TG可有利于消除将信使RNA加工成 最终转录物期间所形成的不必要起始密码子的可能性。因此，内含子的5'或3'末端剪接 接合位点周围的DNA序列可以此方式来修饰。如本文描述和经由在本领域中已知的方法改 变的内含子和内含子变体可如工作实例中所描述来凭经验地测试以确定内含子对于可操 作地连接DNA分子的表达的效应。也可产生包含内含子/外显子剪接接合点的5'和:V 区域的改变以减少引入在加工和剪接信使RNA之后所得转录物中产生的错误起始和停止 密码子的可能性。内含子可如工作实例中所描述凭经验地测试以确定内含子对于转基因的 表达的效应。
[0045] 如本文使用，术语"3'转录终止分子"、"3'未翻译区域"或"3'UTR"是指在mRNA 分子的3'部分的未翻译区域的转录期间所使用的DNA分子。mRNA分子的3'未翻译区域 可通过特异性裂解和也称为聚腺苷酸尾部的3'多聚腺苷酸化来产生。3'UTR可以可操 作地连接至和位于可转录DNA分子的下游并且可包括多聚腺苷酸化信号和能够影响转录、 mRNA处理或基因表达的其他调控信号。聚腺苷酸尾部被认为在mRNA稳定性和启始翻译中 起