] 因此，在与种子优选启动子可操作连接时，每个不同苜蓿3'UTR不同地影响发育 种子中的表达。对于表达的效应的这些差异可用于提供种子表达的更精制和定制途径并且 可理想地适合于"微调"其中需要种子表达的特定可转录DNA分子的表达谱。
[0162] 实施例5
[0163] 分析3'UTR对于稳定地转化大豆植物中的组成性⑶S表达的效果。
[0164] 大豆植物用载体，尤其质粒构建体转化，以评估选定蒺藜状苜蓿3'UTR对于表 达的效应。具体来说，大豆植物用含有驱动可操作地连接至苜蓿3'UTR的葡糖醛酸 酶（GUS)转基因的表达的展现组成性表达谱的两个不同EXP序列的载体转化。这些苜蓿 3'UTR转化植物与转化大豆植物比较，其中GUS转基因的表达可操作地连接至来自海岛棉 的 3'UTR。
[0165] 用于这些实验中的植物载体使用在本领域中已知的克隆方法来建立。所得载体 包含来自根癌农杆菌的左边界区域；选择赋予抗生素大观霉素的抗性（由拟南芥肌纤蛋白 7启动子驱动）的转化植物细胞的第一转基因表达盒；用于评估3'UTR的活性的第二转 基因表达盒，所述YUTR包含Y可操作地连接至具有可加工内含子（⑶S-2，SEQIDN0: 44)的⑶S的编码序列的EXP元件EXP-CaMV. 35S-enh+Ph.DnaK:1 :3(SEQIDNO:42)或 EXP-DaMV.FLT:l:2(SEQIDN0:51)，所述可加工内含子5'可操作地连接至来自蒺藜状苜 蓿或海岛棉的3'UTR;和来自根癌农杆菌的右边界区域。包含来自苜蓿的3'UTR的载体 是pMONl18768、pMONl53701 和pMONl16803。包含来自海岛棉的 3 'UTR的载体是pMONl21042 和PM0N102167。
[0166] 表18提供具有用于转化在此实施例中呈现的大豆植物的相应EXP元件、3'UTR 和SEQIDN0的质粒构建体。
[0167] 表18.用于转化大豆植物的质粒构建体和相应EXP元件和3'UTR。
[0168]
[0169]
[0170] 将植物转化并且所测定的⑶S如实施例3中描述。表19和20提供R。世代稳定 转化大豆植物的定量平均GUS值。
[0171]
[0172]如表 19 和 20 展示，与海岛棉衍生:VUTRT-Gb.E6-3b:1 :1(SEQIDNO:40)相比， 苜蓿 3，UTRT-Mt.Sali3-2-l:2 :1(SEQIDNO:26)和T-Mt.AC140914v20-l:2 :1(SEQID N0:2)不同地影响组成性EXP元件EXP-DaMV.FLT:1:2(SEQIDN0:51)的表达。在许多采 样组织中，存在使用苜蓿3'UTR的表达增强。相对于3'UTRT-Mt.AC140914v20-l:2:1，在 也包含EXP元件EXP-CaMV. 35S-enh+Ph.DnaK:l:3(SEQIDN0:42)的植物的大多数组织中 发现增强。表21和22展示相对于包含来自海岛棉的3'UTR的pM0N121042(T-Gb.E6-3b: 1 :1(SEQIDN0:40))赋予的表达，定量⑶S表达的倍数差异。
[0173]
[0174] 前述实验表明相对于包含来自海岛棉的3'UTR的pM0N121042(T-Gb.E6-3b:1 : 1(SEQIDN0 :40))，每个苜蓿:VUTR对于每个组成性EXP元件的表达水平具有不同效应。 举例来说，EXP-DaMV.FLT:1 :2的表达在Vn5根、Vn5库叶、Vn5源叶、R1源叶、R1叶柄、R1 花朵、黄色圆荚体胚芽、黄色圆荚体子叶、R3圆荚体和R5子叶中增强1. 14至15. 13倍，但 是使用T-Mt.Sali3-2-l:2 :1，在R3未成熟种子中表达减少。此相同EXP元件，在与T-Mt. AC140914v20-l:2 :1组合时，导致Vn5根、Vn5源叶、R1源叶、R1叶柄、R1花朵、黄色圆荚 体胚芽、黄色圆荚体子叶、R3未成熟种子、R3圆荚体和R5子叶中的1. 34至13. 42倍增强， 但是在V5库叶中保持与T-Gb.E6-3b:1 :1(SEQIDNO:40)大约相同。在黄色圆荚体胚芽 中的表达是使用T-Mt.Sali3-2-l:2 :1的黄色圆荚体子叶的约两倍（15. 13相比于7. 23倍 增强），而在使用T-Mt.AC140914v20-l:2 :1时，这两个组织中的表达相对相同（9. 19相比 于 9. 13 倍增强）。相对于EXP元件EXP-CaMV. 35S-enh+Ph.DnaK: 1 :3,与此相同 3'UTR与 EXP-DaMV.FLT:1 :2组合时相比，与T-Mt.AC140914v20-l:2 :1的组合在许多采样组织中产 生较小增强。在R1花朵中，减少表达相对于T-Gb.E6-3b:1 :1在EXP-CaMV. 35S-enh+Ph. DnaK:1 :3 组合与T-Mt.AC140914v20-l:2 :1。EXP-CaMV. 35S-enh+Ph.DnaK:1 :3 与T-Mt. Sali3-2-l:2 :1的组合在Vn5根、Vn5库叶、Vn5源叶、R1源叶、黄色圆荚体胚芽和黄色圆荚 体子叶中提供增强，但是相对于T-Gb.E6-3b:1 :1(SEQIDNO:40)，在R1花朵和R5子叶中 减少表达。
[0175]两个苜蓿 3 'UTR，T-Mt.Sali3-2-l:2 :1 和T-Mt.AC140914v20-l:2 :1，中的每 一个不同地影响两个不同组成性EXP元件EXP-DaMV.FLT:1 :2和EXP-CaMV. 35S-enh+Ph. DnaK:1 :3的表达。在许多组织中，存在相对于T-Gb.E6-3b:1 :1(SEQIDNO:40)的表达增 强，但是在一些组织中，发生表达减少。因此，通过使用不同苜蓿3'UTR，能够更精确控制 植物中的表达并且更好"微调"特异性可转录DNA分子的表达以便在需要可转录DNA分子 的表达时提供最优表达，同时减少可能负面地影响植物的组织中的表达。
[0176] 实施例6
[0177] 蒺藜状苜蓿:VUTRT-Mt.AC145767v28-l:1 :2当在稳定地转化大豆植物中与许 多不同EXP分子组合时导致GUS表达的增强
[0178] 大豆植物用载体，尤其质粒构建体转化，以评估苜蓿3 'UTRT-Mt. AC145767v28-l:1 :2(SEQIDNO:1)对于表达的效应。具体来说，大豆植物用含有具有驱动 可操作地连接至苜蓿YUTRT-Mt.AC145767v28-l:1 :2(SEQIDN0 :1)的葡糖醛酸酶 (⑶S)转基因的表达的组成性表达谱的多个不同EXP的载体转化。这些苜蓿3'UTR-转化 大豆植物与转化大豆植物比较，其中⑶S转基因可操作地连接至来自海岛棉的3'UTR。
[0179]用于这些实验中的载体使用在本领域中已知的克隆方法来建立。所得载体包含 来自根癌农杆菌的左边界区域；选择赋予抗生素大观霉素的抗性（由拟南芥肌纤蛋白7 启动子驱动）的转化植物细胞的第一转基因表达盒；用于评估包含EXP元件的3' UTR T-Mt.AC145767v28-l:l:2(SEQ ID N0:1)的活性的第二转基因表达盒，所述EXP元件 EXP-Mt. AC145767v28 ： 1 ： 1(SEQ ID NO ：35) ^ EXP-CaMV. 35S-enh+Ph. DnaK ： 1 ：3(SEQ ID NO :42)、EXP-BSAcVNV. FLT :1 :2 (SEQ ID NO :52)、EXP-CERV. FLT :1 :2 (SEQ ID NO :53)、 EXP-DaMV. FLT :1 :2 (SEQ ID NO :51)、EXP-CUCme. eEFla :1 :1 (SEQ ID NO :54) SEXP-Mt. Ubq2:l:2(SEQ ID N0:31W可操作地连接至具有可加工内含子（⑶S-2，SEQ ID NO: 44)的⑶S的编码序列，所述可加工内含子5'可操作地连接至来自蒺藜状苜蓿的3' UTR T-Mt.AC145767v28-l :1 :2(SEQ ID NO :1)，或来自海岛棉的 3' UTR T-Gb.E6-3b :1 : 1(SEQIDN0:40)或T-Gb.FbL2-l:l:l(SEQIDN0:41);和来自根癌农杆菌的右边界区 域。包含T-Mt.AC145767v28-l:l:2(SEQIDN0:1)的载体是pM0N118798、pM0N116815、 PM0N118769、pM0N153709、pM0N118771、pM0N153707 和pM0N155502。值得注意的是，载 体PM0N118798包含原生EXP-Mt.AC145767v28 :1 :1，其包含可操作地连接至从与YUTR T-Mt.AC145767v28-l:l:2(SEQIDN0:1)相同的基因座位克隆的前导区元件的启动子元 件。包含 3'UTR来自海岛棉的载体是pM0N102167、pM0N113874、pM0N121030、pM0N121042、 PM0N140827 和pM0N125841。
[0180] 表23提供具有用于转化在此实施例中呈现的大豆植物的相应EXP元件、3'UTR 和SEQIDN0的质粒构建体。
[0181] 表23.用于转化大豆植物的质粒构建体和相应EXP元件和3'UTR。
[0182]
[0183]
[0184] 将大豆植物转化并且所测定的⑶S如实施例3中描述。表24和25提供R。世代 稳定转化大豆植物的定量平均GUS值。标记为"bdl"的表格单元指示得到定量分析但是表 达低于检测水平的组织。表26和27提供相对于T-Gb.E6-3b:1 :1(SEQIDN0 :40)，可操作 地连接至T-Mt.AC145767v28-l:1 :2的每个EXP元件的表达的倍数变化。
[0185]
[0186] CN105143240A 说明书 46/54 页
[0187]
[0188]
[0189]如表 24 和 25 展示，相对于T-Gb.E6-3b:1 :1(SEQIDNO:40)，苜蓿：^17^1'-]\^.AC145767v28-l:1 :2(SEQIDNO:1)增强六个组成性EXP元件的表达，但是以取决于特异性 EXP元件和组织的不同方式。EXP元件，EXP-Mt.AC145767v28 :1 :1，在用于驱动⑶S并且可 操作地连接至其原生3'UTRT-Mt.AC145767v28-l:1 :2时在所有测定组织表达非常低并 且在R3未成熟种子、R3圆荚体和R1花朵中不可检测到。相对于EXP-Mt.Ubq2 :1 :2与T-Gb.FbL2-l: 1 :1 的组合，包含EXP元件EXP-Mt.Ubq2 :1 :2 和 3 'UTRT-Mt.AC145767v28-l: 1 : 2的植物的一些组织展示减少的表达。此减少的表达在R3未成熟种子、R1花朵和R1叶柄 中发现，同时相比之下，Vn5库叶和R5子叶表达增强大于四倍。使用EXP-Mt.Ubq2 :1 :2和 3 ^UTR，根表达（Vn5根）没有变化。
[0190] 调控表达元件组EXP-CERV.FLT: 1 :2和EXP-DaMV.FLT: 1 :2提供最高水平的表达。 如表26和27展示，相对于与T-Gb.E6-3b:1 :1(SEQIDN0:40)组合的相同EXP，这两个EXP 在具有T-Mt.AC145767v28-l:1 :2的所有组织中增强。调控表达元件组EXP-CERV.FLT:1 :2 在发育黄色圆荚体子叶中增强60. 50倍并且在黄色圆荚体胚芽中增强较小（21. 50倍），同 时与在黄色圆荚体子叶中相比，调控表达元件组EXP-DaMV.FLT:1 :2在黄色圆荚体胚芽中 以更大程度增强（分别为26. 80相比于15. 76倍增强）。这些表达和增强差异给予在后期 发育种子中提供转基因的定制表达的机会。在与T-Gb.E6-3b:1 :1组合时，调控表达元件组 EXP-BSAcVNV.FLT:1 :2在R3圆荚体和Vn5根中表达最高（参见表25和26)。在与T-Mt. AC145767v28-l:1 :2组合时，EXP-BSAcVNV.FLT:1 :2在这两个组织中的表达极大地增强， 尤其在Vn5根中。此外，相对于与T-Gb.E6-3b:1 :19(SEQIDN0:40)组合的此相同EXP，在 与T-Mt.AC145767v28-l:1 :2 组合时，EXP-BSAcVNV.FLT:1 :2 的表达增强 58. 63 倍。
[0191]总之，蒺藜状苜蓿 3'UTRT-Mt.AC145767v28-l:1 :2(SEQIDN0 :1)增强来自植 物和植物病毒基因组DNA的六个不同组成性EXP元件的表达。另外，相对于大多数其他苜 蓿衍生 3'UTR，此 3'UTR增强种子优选EXP元件EXP-Gm.Sphasl: 1 :1(SEQIDN0 :54)的 表达。因此，此3'UTR适合于提供启动子或构建体中的可操作地连接表达元件的组合的增 强表达。
[0192] 实施例7
[0193] 分析稳定地转化大豆植物中的EXP-Mt.Ubq2 :1 :2(SEQIDN0 :31)
[0194] 大豆植物用包含可操作地连接至⑶S编码序列的组成性调控表达元件组EXP-Mt. Ubq2 :1 :2(SEQIDNO:31)的用载体，尤其质粒构建体来转化。这些转化植物然后测定在稳 定转化大豆植物中的⑶S表达。
[0195]用于这些实验中的植物载体使用在本领域中已知的克隆方法来建立。所得载体 包含来自根癌农杆菌的左边界区域；选择赋予抗生素大观霉素的抗性（由拟南芥肌纤蛋 白7启动子驱动）的转化植物细胞的第一转基因表达盒；用于评估包含EXP-Mt.Ubq2 :1 :2 的EXP-Mt.Ubq2 :1 :2(SEQIDN0 :31)的活性的第二转基因表达盒，所述EXP-Mt.Ubq2 :1 : 2 5'可操作地连接至具有可加工内含子（⑶S-2，SEQIDN0:44)的葡糖醛酸酶（⑶S) 的编码序列，所述可加工内含子5'可操作地连接至来自蒺藜状苜蓿的3'UTRT-Mt. AC145767v28-l:1 :2(SEQIDN0:1)，或来自海岛棉的 3'UTRT-Gb.E6-3b:l:1(SEQIDNO: 40)或T-Gb.FbL2-l:1 :1(SEQIDN0:41);和来自根癌农杆菌的右边界区域。
[0196] 所得载体用于转化如实施例3描述的大豆植物。表28和29展示在各种组织中测 定的平均定量GUS表达值和稳定转化大豆植物的发育时间点。
[0197] 表28.包含￡乂?-|^.诎92:1:2(3￡〇10勵：31)的稳定转化大豆植物的叶、根和花 中的平均⑶S表达。
[0198]
[0199] 表29.包含EXP_Mt.Ubq2 :1 :2(SEQIDNO:31)的稳定转化大豆植物的圆荚体和 种子组织中的平均⑶S表达。
[0200]
[0201] 如表28和29展示，EXP-Mt.Ubq2 :1 :2(SEQIDN0 :31)能够驱动稳定转化大豆 植物中的可转录DNA分子的组成性表达。此外，不同3'UTR影响每个组织中的表达程度。 举例来说，与其他两个3'17^，！'-613.?此2-1:1 :1和1'-]\^^(：145767￥28-1:1:2相比，将 EXP-Mt.Ubq2 :1 :2与T-Gb.E6_3b:1 :1组合导致在所有测定组织中的较低表达。然而，不论 施用哪一种3'UTR，EXP-Mt.Ubq2 :1 :2提供中等至高等组成性表达，其程度可通过选择哪 一种3'UTR可操作地连接至EXP来调节。
[0202] 实施例8
[0203] 来自调控元件的增强子
[0204] 增强子可来自本文提供的启动子元件，如SEQIDN0 :32和36。增强子元件可包含 一个或多个顺式调控元件，所述顺式调控元件在5'或3'可操作地连接至启动子元件或 或3'可操作地连接至可操作地连接至启动子的额外增强子元件时，可增强或调节可转 录DNA分子的表达，或提供可转录DNA分子特异性在细胞类型或植物器官中，或在发育或昼 夜节律中的具体时间点处的表达。增强子通过移除TATA盒或功能类似元件和允许转录从 启动子或启动子片段启始的任何下游序列来产生。
[0205] 增强子元件可来源于本文提供的启动子元件并且使用在本领域中已知的方法来 克隆以5'或3'可操作地连接至启动子元件或5'或3'可操作地连接至可操作地连接至 启动子的额外增强子元件。或者，增强子元件可使用在本领域中已知的方法来克隆以便可 操作地连接至增强子元件的一个或多个复本，其5'或3'可操作地连接至启动子元件，或 或3'可操作地连接至可操作地连接至启动