kage的版本10中使用的评分矩阵为 BL0SUM62(参见Henikoff和Henikoff (1989)Proc.Natl .Acad. Sci .USA 89:10915)。
[0056] (C)在两条核酸或多肤序列的情形中，本文所用的"序列同一性"或"同一性"是指 在指定的比较窗口范围为获得最大对应而比对时运两条序列中相同的残基。当序列同一性 百分比针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨 基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变 分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可W上调序列同一性百分比W校正置换的 保守性质。差别在于运种保守置换的序列被称为具有"序列相似性"或"相似性"。作出运个 调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，运设及将保守置换评定为部分错配而不是完 全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换 给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE (Intelligenetics，Moun1:ain View,California)中所执行那样进行计算。
[0057] (d)本文所用的"序列同一性百分比"意指通过在比较窗口范围内比较两个最佳比 对的序列所确定的数值，其中与参考序列（不包含添加或缺失)相比，多核巧酸序列在比较 窗口中的部分可包含添加或缺失（即空位），W便最佳比对两个序列。通过W下方式计算所 述百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目W得到匹配的 位置的数目，将匹配的位置的数目除W比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘WlOOW得 到序列同一性百分比。
[005引（e)术语多核巧酸序列的"实质同一性"意指某多核巧酸序列与参考序列相比，具 有至少70 %、80 %、90 %、95 %的序列同一性，所述百分比是用所述比对程序之一，采用标准 参数得到的。
[0059] 两条核巧酸序列实质上相同的另一指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。通 常，将严格条件选择为比特定序列在确定的离子强度和抑下的Tm低约fTC。但是，严格条件 涵盖在比化低约rc至约20°C的范围内的溫度，取决于本文另外限定的所需严格程度。
[0060] 如本文所用，术语"植物"包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物 细胞组织培养物、植物愈伤组织、W及在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞诸如 胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。巧粒意在表 示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所培育的成熟种子。再生的植物的子代、 变体和突变体也包括在本公开的范围内，前提条件是运些部分包含引入的多核巧酸。
[0061] 本公开可用于任何植物物种(包括但不限于单子叶植物和双子叶植物）的转化。植 物物种的示例包括:玉米(Zea mays);芸苔属(Brassica)物种(例如甘蓝型油菜(B.napus)、 宪菁（B.rapa)、芥菜（B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种；首猜 (Medicago sativa)、稻（Oiyza sativa)、黑麦（Secale cereale)、高梁（Sor曲um bicolor， Sor曲um vulgare)、粟（例如珍珠粟（Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、谷 子（Setaria italica)、龙爪稷（Eleusine coracana));向日葵(Helianthus annuus);红花 (Carthamus tinctorius);小麦（Triticum aestivum)、大豆（Glycine max)、烟草 (Nicotiana tabacum)、马铃馨（Solanum tuberosum)、落花生（Arachis hypogaea)、棉花 (海岛棉（Gossypium barbadense)、陆地棉（Gossypium hirsutum));甘馨（Ipomoea batatus);木馨（Manihot esculenta);咖啡（Coffea spp.);挪子（Cocos nucifera);渡萝 (Ananas comosus);相橘树（Citrus spp .);可可（Theobroma cacao);茶（Camellia sinensis);香蕉（Musa spp.);鳄梨（Persea americana);无花果化i州S casica);番石恼 (Psidium gua java);芒果（Mangifera indica);橄揽（Olea europaea);木瓜（Carica papaya);腰果（Anacardium occidentale);澳洲坚果（Macadamia integrif0Iia);杏树 (Primus amygdalus);糖用甜菜（Beta vulgaris);甘薦（Saccharum spp.);燕麦；大麦；蔬 菜;观赏植物和针叶树。
[0062] 蔬菜包括番茄化ycopersicon esculentum)、窝宦（例如Lactuca sativa)、青豆 (Phaseolus vulgaris)、利马豆（Phaseolus Iimensis)、魏豆（香魏豆属(Xathyrus)物种） 和黄瓜属（加。1111113)的成员诸如黄瓜（〔.3曰1：；[￥113)、香瓜（〔.。曰]11曰1叩6]1313)和甜瓜 (C.melo)。观赏植物包括杜酷（杜酷花属（Rhododendron)物种）、八仙花（MacrophyIla hy化angea)、朱穫化;Lbiscus rosasanensis)、玫瑰(菩薇属(Rosa)物种）、郁金香(郁金香属 (TuIipa)物种）、水仙（水仙属（NarciSSUS)物种）、矮牵牛（Petunia hybrida)、康乃馨 (Di曰nthus c曰ryophyllus)、一品红（Euphorbi曰 pulcherrim曰）和菊花。
[0063] 可用于实施本公开的针叶树包括(例如)松树诸如火炬松(Pinus taeda)、湿地松 (Pinus elliotii)、西黄松（Pinus ponderosa)、黑松（Pinus conto;rta)和福射松（Pinus radiata);花旗松（PseudotSUga menziesii);西部铁杉（Tsuga canadensis);北美云杉 (Picea glauca);红杉（Sequoia sempervirens);秋树（true firs)诸如银秋（Abies amabilis)和胶秋(Abies balsamea); W及雪松诸如西方红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯 加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。在特定实施方案中，本公开的植物是作物植物 (例如玉米、首猜、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高梁、小麦、粟、烟草等）。在 其他实施方案中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他实施方案中，玉米植物是最佳的。
[0064] 其他感兴趣的植物包括提供感兴趣的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植 物。感兴趣的种子包括谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、稻、高梁、黑麦等。油料种子植物包 括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀泰、首猜、栋桐、挪子等。豆科植物包括豆类和魏豆。 豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦己、大豆、四季豆、班豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
[0065] 如本文所用，术语"可转录多核巧酸分子"是指任何能够被转录为RNA分子的DNA分 子，包括但不限于那些具有蛋白质编码序列的DNA分子，和那些具有可用于抑制基因的序列 的DNA分子。"转基因 "是指与宿主细胞异源的可转录多核巧酸分子和/或被人为渗入宿主细 胞基因组的可转录多核巧酸分子。
[0066] 本发明的调控元件能够可操作地连接至相对调控分子为异源的可转录多核巧酸 分子。如本文所用，术语"异源"是指两个或两个W上多核巧酸分子的组合，运种组合通常不 存在于自然界。举例来说，运两个分子可源自不同物种，并且/或者运两个分子可源自不同 基因（例如，源自相同物种的不同基因，或源自不同物种的相同基因）。因此，如果运种组合 通常不存在于自然界，则调控元件相对于可操作地连接的可转录多核巧酸分子是异源的， 良P，所述可转录多核巧酸分子不会天然与所述调控元件分子W可操作地连接方式组合在一 起。
[0067] 可转录多核巧酸分子通常可为表达RNA转录物所需的任何DNA分子。RNA转录物的 运种表达可导致得到的mRNA分子翻译，因而导致蛋白质表达。另选地，可将可转录多核巧酸 分子设计成最终导致特定基因或蛋白质的表达降低。运一点可通过使用W反义方向取向的 可转录多核巧酸分子来实现。本领域的普通技术人员很熟悉运种反义技术的步骤。简言之， 在转录可转录的反义多核巧酸分子时，RNA产物在细胞内与互补RNA分子杂交，并将互补RNA 分子隔离。运种双螺旋RNA分子不能通过细胞的翻译机制翻译为蛋白质，随后在细胞内降 解。可采用运种方式负调控任一种基因。
[0068] 因此，本发明的一个实施方案是本发明的调控元件，诸如SEQ ID N0:1至3示出的 那些调控元件，运些调控元件可操作地连接至可转录多核巧酸分子，运样一来，一旦所述构 建体被引入植物细胞，运些调控元件便可按期望水平或按期望模式调控可转录多核巧酸分 子的转录。在一个实施方案中，可转录多核巧酸分子包含基因的蛋白质编码区，并且启动子 影响RNA分子转录，继而影响RNA分子被翻译和表达为蛋白质产物。在另一个实施方案中，可 转录多核巧酸分子包含基因的反义区域，并且启动子影响反义RNA分子或其他相似的抑制 性RNA分子的转录，从而抑制祀标宿主细胞中感兴趣的特定RNA分子的表达。
[0069] 由本公开的PVCV调控元件表达的可转录多核巧酸分子可用于改变植物的表型。表 型的各种变化值得关注，包括更改基因的表达、改变植物对病原体或昆虫的防御机制、提高 植物在植物中对除草剂的耐受性、改变根发育W应对环境胁迫、调节植物对盐、溫度(热和 寒冷）、干旱的响应等等。运些结果可通过表达包含适当基因产物的感兴趣的异源核巧酸序 列来获得。在特定实施方案中，感兴趣的异源核巧酸序列是在植物或植物部分中表达水平 提升的植物内源序列。另选地，运些结果可W通过引起植物中一种或多种内源基因产物，尤 其酶、转运蛋白或辅因子的表达降低或者通过影响植物中营养物摄取来实现。运些改变导 致转化植物的表型变化。
[0070] 农学上感兴趣的基因
[0071] 可转录多核巧酸分子可W是农学上感兴趣的基因。如本文所用，术语"农学上感兴 趣的基因"是指当在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时，提供与植物形态、生理、生 长、发育、产量、产物、营养分布、疾病或害虫抗性和/或环境或化学耐受性相关的所需特征 的可转录多核巧酸分子。农学上感兴趣的基因包括但不限于：编码产量蛋白、应激抗性蛋 白、发育控制蛋白、组织分化蛋白、分生组织蛋白、环境响应蛋白、衰老蛋白、激素响应蛋白、 脱落蛋白、来源蛋白、SINK蛋白、花控制蛋白、种子蛋白、除草剂抗性蛋白、疾病抗性蛋白、月旨 肪酸生物合成酶、生育酪生物合成酶、氨基酸生物合成酶、杀虫蛋白或任何其他试剂(诸如 祀向抑制特定基因的反义或RNAi分子）的那些基因。农学上感兴趣的基因的产物可在植物 体内起作用，影响植物的生理或代谢;或可充当杀虫剂，杀灭W植物为食的害虫。
[0072] 在一个实施方案中，将本公开的调控元件渗入构建体，使该调控元件可操作地连 接至作为农学上感兴趣的基因的可转录多核巧酸分子。为赋予植物农学有益性状，期望农 学上感兴趣的基因表达。有益农学性状可W例如是但不限于：除草剂耐受性、昆虫防治、产 量改良、真菌疾病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌疾病抗性、植物生长和发育、产生淀粉、油 产量改良、高油产量、脂肪酸含量改良、高蛋白质产量、果实成熟、动物和人类营养提高、产 生生物聚合物、环境压力抗性、产生药用肤类和可分泌肤类、加工性状改良、可消化性改良、 产生酶、产生香气、固氮性、杂交制种、产生纤维、产生生物燃料。
[0073] 昆虫抗性基因可W编码针对严重影响产量的害虫的抗性，所述害虫诸如是根虫、 切根虫、欧洲玉蜀泰惧等。运类基因包括（例如）苏云金芽抱杆菌（Baci Ilus thuringiensis)毒性蛋白基因（美国专利 5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5， 593，881;和 Geiser 等人（1986)Gene48:109)等等。
[0074] 编码抗病性性状的基因包括解毒基因，诸如对伏马菌素解毒的那些基因（美国专 利5,792,931);无毒力(avr)基因和抗病性(R)基因 （Jones 等人（1994)Science 266:789; 1日的111等人（1993)5。1611。6 262:1432;和]\1111化111〇3等人（1994)〔611 78:1089)等等。
[0075] 除草剂抗性性状可W包括编码针对起到抑制乙酷乳酸合酶(ALS)之作用的除草剂 的抗性的基因，特别是横酷脈型除草剂(例如含有导致运种抗性的突变特别是S4和/或化a 突变的乙酷乳酸合酶(ALS)基因）；编码对能抑制谷氨酷胺合酶的作用的除草剂的抗性的基 因，诸如草胺麟或basta(例如bar基因）；草甘憐(如，EPSPS基因和GAT基因；参见(例如）美国 专利公布20040082770和WO 03/092360)或本领域已知的其他此类基因。bar基因编码针对 除草剂basta的抗性，吨tll基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，并且ALS基因 突变体编码针对除草剂氯横隆的抗性。
[0076] 草甘憐抗性由突变的5-締醇式丙酬酷-3-憐酸莽草酸合酶化PSP)基因和aroA基因 赋予。参见(例如）Sh址等人的美国专利4,940,835，其公开了6?51^形式的能赋予草甘憐抗 性的核巧酸序列。Bar巧等人的美国专利5,627,061也描述了编码EPSI^酶的基因。还可参见 美国专利 6,248,876B1、6,040,497、5,804,425、5,633,435、5，145,783、4,971，908、5,312, 910、5，188,642、4,940,835、5,866,775、6,225，114B1、6，130,366、5,310,667、4,535,060、 4,769,061、5,633,448、5,510,471、尺6.36,449、尺6 37,287 ￡和5,491，288;^及国际公布胖0 97/04103、W0 97/04114、W0 00/66746、W0 01/66704、W0 00/66747和WO 00/66748,出于此 目的将运些专利W引用方式并入本文。草甘憐抗性也被赋予表达编码草甘憐氧化还原酶的 基因的植物，如美国专利5，776，760和5，463，175中更完全地描述，出于此目的将运两份专 利W引用方式并入本文。另外，可通过过量表达编码草甘憐N-乙酷转移酶的基因，来赋予植 物草甘憐抗性。参见(例如)美国专利7，714，188和7，462，481。
[0077] 监管批准的农学上感兴趣的基因是本领域技术人员熟知的，可见于环境风险评估 中屯、（cera-gmc. org/?act ion = gm_c;rop_database，可使用WWW前缀对其进行访问）和国际 农业生物技术应用服务组织（International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications) (isaaa. org/gmapprovaldatabase/default.asp，可使用WWW前缀 对其进行访问）。
[0078] 外源产物包括植物酶和植物产物，W及来自包括原核生物和其他真核生物在内的 其他来源的那些产物。运类产物包括酶、辅因子、激素等。
[0079] 其他适用基因及其相关表型的示例包括编码病毒外壳蛋白和/或RNA的基因或者 赋予病毒抗性的其他病毒基因或者植物基因；赋予真菌抗性的基因；促进产量提高的基因； W及提供针对胁迫的抗性的基因，所述胁迫诸如为寒冷、因干旱、热和盐度引起的