脱水、有 毒金属或者痕量元素等。
[0080] 如上所述，与本文公开的PVCV调控元件可操作地连接的异源核巧酸序列可W是祀 向基因的反义序列。因此，本文所公开的启动子序列可W可操作地连接至反义DNA序列，W 降低或抑制植物根中天然蛋白的表达。
[0081] "RNAi"是指用于降低基因表达的一系列相关技术（参见例如美国专利6,506， 559)。由其他名称所指的较老技术现在据认为基于相同的机制，不过在文献中被赋予不同 的名称。运些名称包括"反义抑制"，即产生能够抑制目标蛋白质的表达的反义RNA转录物， W及"共抑制"或"正义抑制"，指产生能够抑制相同的或者实质上相似的外来基因或者内源 基因的表达的正义RNA转录物(美国专利5,231，020, W引用方式并入本文）。运种技术依赖 于使用能导致积累运样的双链RNA的构建体，该双链RNA中的一条链与要沉默的祀标基因互 补。各实施方案的PVCV调控元件可用来驱动将会导致RNA干扰的构建体（包括微RNA和 SiRNA)表达。
[0082] 本公开的调控元件序列或其变体或片段可操作地连接至感兴趣的异源核巧酸序 列时，可驱动该异源核巧酸序列在表达该构建体的植物中W组成型方式表达。"异源核巧酸 序列"是不与本公开的调控元件序列一同天然存在的序列。虽然运种核巧酸序列对调控元 件序列来说是异源的，但相对植物宿主可W是同源的或者说天然的，也可W是异源的或者 说外来的。
[0083] 可对本公开的分离的调控元件序列进行修饰，使所述异源核巧酸序列W-系列水 平表达。因此，可利用完整调控元件区域的一部分，且驱动感兴趣的核巧酸序列表达的能力 得到保持。应认识到，可采用不同方式缺失掉调控元件序列的一部分，来改变mRNA的表达水 平。如果(例如)在截短过程中移除(阻遏蛋白的）负调控元件，则因调控元件缺失，mRNA表达 水平可能降低，或者另选地，其表达可能增加。通常，使用至少约20个核巧酸的分离的调控 元件序列来驱动核巧酸序列表达。
[0084] 应认识到，为提高转录水平，可将增强子与本公开的调控元件区域结合使用。增强 子是起增加调控元件区域表达的作用的核巧酸序列。增强子是本领域已知的，包括SV40增 强子区、35S增强子元件等。我们还知道，有些增强子可改变调控元件正常的表达模式，例如 通过引起调控元件W组成型方式表达，没有该增强子时，同一调控元件只在一个特定组织 或一些特定组织中表达。
[0085] 对本公开的分离的调控元件序列进行修饰，可使异源核巧酸序列W-系列水平表 达。因此，可将运些调控元件序列修饰为弱启动子或强启动子。通常，"弱启动子"是指W低 水平驱动编码序列的表达的启动子。"低水平"表达意指W约1/10,000个转录物至约1/100， 000个转录物至约1/500,000个转录物的水平表达。相反地，强启动子W高水平或者说W约 1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达。
[0086] 已经认识到，本公开的PVCV调控元件可用来增加或减少表达，从而导致转化植物 的表型改变。运种表型变化可能进一步影响已转化植物的组织中金属离子水平的增加或减 少。
[0087]本公开的核巧酸序列W及其变体和片段可用于对植物进行遗传操纵。PVCV调控元 件序列在与待控制其表达W实现所需表型响应的异源核巧酸序列可操作地连接时，可用于 运个方面。术语"可操作地连接的"，意指异源核巧酸序列的转录或翻译受调控元件序列的 影响。W此方式，可将本公开的调控元件的核巧酸序列与感兴趣的异源核巧酸序列一同在 表达盒中提供，W便在感兴趣的植物中，更具体地，在植物的根中表达。
[008引本公开实施方案的调控序列在DNA构建体中提供，用于在感兴趣的生物体内表达。 如本文所用，"表达盒"意指包含本公开实施方案的调控元件序列的DNA构建体，其中该调控 元件序列可操作地连接至编码感兴趣的多肤的异源多核巧酸。运种表达盒包含转录起始 区，该转录起始区包含可操作地连接至异源核巧酸序列的本公开的调控元件核巧酸序列之 一或其变体或片段。运种表达盒可具有多个限制位点，用于使插入该核巧酸序列的过程受 调控区的转录调控。表达盒可另外含有选择性标记基因 W及y终止区。
[0089] 表达盒在转录的5/-3/方向上可包含转录起始区（即本公开的启动子或其变体或 片段）、翻译起始区、感兴趣的异源核巧酸序列、翻译终止区，并且任选地包含在宿主生物中 有功能的转录终止区。本公开实施方案的调控区（即启动子、转录调控区和翻译终止区）和/ 或多核巧酸对于宿主细胞来说或彼此间可W是天然的/同功的。另选地，本公开实施方案的 调控区和/或多核巧酸对于宿主细胞来说或彼此间可W是异源的。如本文所用，与序列有关 的"异源"，是指该序列源于外来物种，或者，如果源于同一物种的话，则是通过蓄意人为干 预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接 至异源多核巧酸的启动子来自与得到该多核巧酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/ 类似的物种，那么一方或双方大体上由它们的原来形式和/或基因组位点修饰得到，或者该 启动子不是被可操作地连接的多核巧酸的天然启动子。
[0090] 终止区对于转录起始区可为天然的，对于可操作地连接的感兴趣的DNA序列可为 天然的，对于植物宿主可为天然的，或者可能源自另一来源（即，对启动子、被表达的DNA序 列、植物宿主或它们的任何组合来说为外来的或异源的）。易得的终止区可获自根瘤农杆菌 (A. tumefaciens)的Ti质粒，诸如章鱼碱合酶和姻脂碱合酶终止区。还可参见Guerineau等 人（1991 )Mol.Gen.Genet.262:141-144;Prou壯oot( 1991 )Cell 64:671-674;Sanfacon等人 (1991)Genes Dev.5:141-149;Mogen等人（1990)Plant Cell 2:1261-1272;Munroe等人 (1990)Gene 91:151-158;Ballas等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891-7903;和化sM 等人（1987)Nucleic Acid Res. 15:9627-9639。
[0091] 包含本公开的序列的表达盒还可含有要共转化到该生物体中的基因的至少一条 另外的核巧酸序列。另选地，所述一条或多条另外的核巧酸序列可W在另一表达盒中提供。
[0092] 在适当的情况下，可W优化其表达待处于本公开的组成型启动子序列控制下的核 巧酸序列和任何另外的一条或多条核巧酸序列，W便在转化的植物中增加表达。也就是说， 可使用植物偏好的密码子来合成运些核巧酸序列，从而改进表达。有关宿主偏好的密码子 使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant I^ysiol.92:1-11。合成植物偏好基 因的方法是本领域现成的。参见例如美国专利5，380，831和5，436，391，W及Murray等人 (1989)Nucleic Acids Res.17:477-498,运些专利和文献W引用方式并入本文。
[0093] 已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。运些序列修饰包括消除W 下序列:编码假多腺巧酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列，W及 其他此类得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可W将异源核巧酸序列的G-C含量 调整至给定细胞宿主的平均水平，所述平均水平通过参考该宿主细胞中表达的已知基因来 计算。当可能时，修饰序列W避免可预见的发夹二级mRNA结构。
[0094]表达盒可W另外含有5/前导序列。此类前导序列可W起到增强翻译的作用。翻译 前导序列是本领域已知的并且包括小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列（脑屯、肌 炎5'非编码区）（Elro厂Stein等人（1989)Proc .Nat .Acad. Sci .USA 86:6126 6130);马铃馨 Y病毒前导序列，例如TEV前导序列（烟草蚀纹病毒KAllison等人（1986)Virology 154:9 20) ;MDMV前导序列（玉蜀泰矮花叶病毒）；人免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP) (Macejak等人 (1991)化化re 353:90 94);来自首猜花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导 序列（Jobling等人（1987)化ture 325:622 625);烟草花叶病毒前导序列（TMVKGallie等 人（1989)Molecular Biology Of RNA，第237 256页）；W及玉蜀泰稱绿斑驳病毒前导序列 (MCMVKLommel等人（1991)Virology 81:382 385)。还可参见Delia Cioppa等人（1987) Plant曲ysiology 84:965 968。也可采用已知的用来提高mRNA稳定性的方法，例如内含 子，诸如玉蜀泰泛素内含子（畑ristensen和Quail (1996)Transgenic Res . 5 : 213-218 ; Qiristensen等人（1992)Plant Molecular Biology 18:675-689)或者玉蜀泰A化I内含子 (Kyozuka等人（1991 )Mol. Gen. Genet. 228:40-48 ;Kyozuka等人（1990)Maydica 35 :353-357)等等。
[00M]在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，W便提供处于正确取向的DNA序列， 并且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段 连接在一起，或者可设及其他的操纵W提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制 性位点等。为此目的，可能设及到体外诱变、引物修复、限制、复性、再置换，例如转换和颠 换。
[0096] 可W在表达盒中包含报告基因或者选择性标记基因。本领域已知的合适报告基因 的示例可 W见于（例如）W下文献：Jeff erson等人（1991) ,Plant Molecular Biology Manual ,GeIvin等人编辑化Iuwer Academic 化blishers)，第1-33页；DeWet等人（1987) Mol. Cell. Biol. 7 :725-737 ; Goff 等人（1990 )EMB0 J. 9 :2517-2522; Kain 等人（1995) BioTechniquesig:650-655;和Qiiu等人（1996)Qirrent Biology 6:325-330。
[0097] 用于选择转化细胞或者组织的选择性标记基因可W包括赋予抗生素抗性或除草 剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的示例包括但不限于:编码针对W下物质的抗性的 基因：氯霉素化errera Estrella等人（1983化MBO J.2:987-992);甲氨噪岭化errera Estrella等人（1983)化ture303:209-213;Meijer等人（1991 )Plant Mol.Biol. 16:807-820);潮霉素 （waldron 等人（1985 )Plant Mol. Biol. 5 :103-108;和 Zhijian 等人（1995) Plant Science 108:219-227);链霉素（Jones等人（1987)Mol.Gen.Genet.210:86-91);壮 观霉素 （Breta 即 e-Sa 即 ard 等人（igge^ransgenic 1?63.5:131-137);博来霉素化1116等人 (1990)Plant Mol .Biol.7:171-176);横酷胺（Guerineau等人（1990)Plant Mol .Biol. 15: 127-136);漠苯腊（Stalker等人（1988)Science 242:419-423);草甘麟（Shaw等人（1986) Science 233:478-481; W及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692);草胺麟 (DeBlock等人（1987化MBO J.6:2513-2518)。
[0098] 可W在回收转基因事件中发挥作用但在最终产物中可能不需要的其他基因将包 括但不限于诸如W下示例:GUS(0-葡糖醒酸酶;Jefferson(1987)Plant Mol .Biol .R邱.5: 387)，6。？（绿色巧光蛋白；畑日1門6等人（1994)5。1611。6 263:802)，巧光素酶（1^旨旨3等人 (1987) Nucleic Acids Res.15(19):8115?及Luehrsen等人（1992)Methods Enzymol.216: 397-414)，W及编码花青素生产的玉蜀泰基因（Ludwig等人（1990)Science247:449)。
[0099] 包含本公开的可操作地连接至感兴趣的核巧酸序列的PVCV调控元件的表达盒可 用于转化任何植物。W此方式，可W获得基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子、根等。
[0100] 本公开的方法设及将多肤或者多核巧酸引入到植物中。"引入"意在指W使得多核 巧酸或多肤的序列得W进入植物细胞内部的方式，将多核巧酸或多肤呈送给植物。本公开 的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核巧酸或多肤进入植物的至少一个 细胞的内部即可。将多核巧酸或多肤引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定 转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
[0101] "稳定转化"意在指被引入植物中的核巧酸构建体整合进植物的基因组中，并能够 由其后代继承。"瞬时转化"意在指多核巧酸被引入植物中但没有整合进植物的基因组中， 或者多肤被引入植物中。
[0102] 转化方案W及将核巧酸序列引入植物的方案，可W视转化所祀向的植物或植物细 胞的类型（即单子叶植物或双子叶植物)而不同。将核巧酸序列引入植物细胞中并随后插入 植物基因组中的合适方法包括：微量注射法（Crossway等人（1986)Biotechniques 4:320 3：34)、电穿孔法（Riggs 等人（1986 )Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602 5606)、农杆菌 (Agrobacterium)介导的转化法(Townsend等人，美国专利5,563,055和Zhao等人，美国专利 5,981,840)、直接基因转移法(Paszkowski等人（1984化MBO J.3:2717 2722)和弹道粒子加 速法(参见例如美国专利 4,945,050、5,879,918、5,886,244、5,932,782;Tomes 等人（1995)， Plant Cell,Tissue,and Organ Culture：Fundamental Methods,Gamborg和Phillips编车茸 (Springer-Verlag'Berlin) ;Mc(^ibe等人（1988)Biotechnology 6:923 926); W及Lecl转 化法(WO 00/28058)。还可参见Weissinger等人（1988)Ann.Rev.Genet.22:421477;Sanford 等人（1987)化；rti州late Science and Technology 5:27 37(洋葱）；Qi;ristou等人（1988) Plant 曲ysiol.87:671 674(大豆）；McCabe等人（1988)Bio/Technology 6:923 926(大 豆）；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell 〇6￥.81〇1.27?:175-182(大豆）；5111邑11等人 (1998)1^601".Appl .Genet. 96: 319-324(大豆）；Datta等人（1990)Biotechnology 8:736 740(稻）；Klein等人（1988)Proc.化tl.Acad.Sci.USA 85:4305 4309(玉蜀泰）；Klein等人 (1988) Biotechnology 6:559 563(玉蜀泰）；美国专利5，240，855、5，322，783和5，324，646; Klein等人（1988)Plant 曲ysiol .91:440 44