淀粉酶 的宿主细胞所产生的培养细胞材料的形式添加。淀粉酶还可在发酵或SSF过程期间由宿主 细胞分泌到反应培养基中，使得酶连续地提供到反应中。产生且分泌淀粉酶的宿主细胞还 可表达另外的酶，诸如葡糖淀粉酶。例如，美国专利5,422,267公开在酵母中使用葡糖淀粉 酶用于生产酒精饮料。例如，宿主细胞例如里氏木霉或黑曲霉可工程化W在糖化期间共表 达淀粉酶和葡糖淀粉酶，例如化GA、TrGA或化GA变体。宿主细胞可经过基因修饰，W使不表 达它的内源性葡糖淀粉酶和/或其它酶、蛋白质或其它物质。宿主细胞可工程化W表达广谱 的各种糖化酶。例如，重组酵母宿主细胞可包含编码葡糖淀粉酶、Q-葡糖巧酶、利用戊糖的 酶、Q-淀粉酶、普鲁兰酶、异淀粉酶和/或异普鲁兰酶的核酸。参见例如WO 2011/153516A2。 [0巧0] 4.4.异构化
[0251]通过用淀粉酶处理所产生的可溶性淀粉水解产物可转化成高果糖淀粉基糖浆 化FSS)，诸如高果糖玉米糖浆化FCS)。此转化可使用葡萄糖异构酶，尤其是固定在固体支持 体上的葡萄糖异构酶来实现。pH增加至约6.0至约8.0,例如pH 7.5(取决于异构酶），并且 Ca2+通过离子交换来除去。合适的异构酶包扣SWEETZYME'K，[T(NovozymesA/S); G-ZYME?IMGI和G-ZYME&G993、KETOMAX?、G-ZYME?G993、G_ZYME|@G993 液体和GENS WEET ? IGI。在异构化之后，混合物通常含有约40 % -45 %果糖，例如42 %果 糖。
[0况]4.5.发酵
[0253]可溶性淀粉水解产物，尤其是富含葡萄糖的糖浆，可通过通常在约32°C，诸如针对 产醇酵母30°C至35°C的溫度下，将淀粉水解产物与发酵生物接触来发酵。发酵的溫度和pH 将取决于发酵生物。EOF产物包括代谢物，诸如巧樣酸、乳酸、班巧酸、谷氨酸一钢、葡萄糖 酸、葡萄糖酸钢、葡萄糖酸巧、葡萄糖酸钟、衣康酸和其它簇酸、葡萄糖酸S-内醋、异抗坏血 酸钢、赖氨酸和其它氨基酸、《3脂肪酸、下醇、异戊二締、I，3-丙二醇、丙酬酸、2,3-下二醇 和其它生物物质。
[0254] 产乙醇微生物包括酵母诸如酿酒酵母，和细菌例如运动发酵单胞菌（Zymomonas moblis)，其表达醇脱氨酶和丙酬酸脱簇酶。产乙醇微生物可表达木糖还原酶和木糖醇脱氨 酶，运些酶将木糖转化成木酬糖。例如可经受高溫的改善的产乙醇微生物菌株为本领域中 已知的，并且可使用。参见Liu等人（2011)化eng Wu Gong化eng Xue Bao(生物工程学报） 27: 1049-56。酵母的商业来源包括 ETHANOL 民 ED" (LeSaffre) ;THE 民 MOSACC 均 (La 11 emand ) ; RED STA 民巧)（Red Star ) ； FERMIOL? ( DSM Sp e c i a 11 i e s );和 SUPE反START? (Alltech)。通过发酵产生其它代谢物诸如巧樣酸和乳酸的微生物也是 本领域中已知的。参见例如，Papagianni (2007)Biotechnol. Adv. 25 : 244-63 ; John等人 (2009)Biotechnol.Adv.27:145-52。
[0255] 糖化和发酵过程可WSSF过程的形式进行。发酵可包括例如乙醇的后续富集、纯化 和回收。在发酵期间，肉汤或"啤酒"的乙醇含量可达到约8%-18% v/v，例如14%-15% v/v。 肉汤可蒸馈W产生富集的例如96%纯乙醇溶液。另外，通过发酵生成的C〇2可用C〇2涂气器收 集、压缩且销售用于其它用途，例如碳酸饮料或干冰生产。发酵过程的固体废物可用作富含 蛋白质的产品，例如牲畜饲料。
[0256] 如上所述，SSF过程可用在整个SSF中连续地表达且分泌淀粉酶的真菌细胞进行。 表达淀粉酶的真菌细胞可为发酵微生物，例如产乙醇微生物。乙醇生产因此可使用表达足 够的淀粉酶或海藻糖酶使得必须外源性添加的酶较少或不必外源性添加酶的真菌细胞进 行。真菌宿主细胞可来自适当工程化的真菌菌株。也可使用表达且分泌除淀粉酶或海藻糖 酶之外的其它酶的真菌宿主细胞。此类细胞可表达葡糖淀粉酶和/或普鲁兰酶、植酸酶、曰-葡糖巧酶、异淀粉酶、e-淀粉酶纤维素酶、木聚糖酶、其它半纤维素酶、蛋白酶、e-葡糖巧酶、 果胶酶、醋酶、氧化还原酶、转移酶或其它酶。
[0257] 此过程的变型为"补料分批发酵"系统，其中底物随着发酵进程W增量的形式添 加。当分解代谢物阻遏可抑制细胞代谢并且当希望在培养基中具有有限量的底物时，补料 分批系统是可用的。补料分批系统中实际底物浓度通过可测量因素诸如抑、溶解氧和废气 诸如C〇2的分压的变化来估计。分批和补料分批发酵是常见的并且是本领域中熟知的。
[0258] 连续发酵为开放系统，其中将限定的发酵培养基连续地添加到生物反应器中，并 且同时除去等量的条件培养基用于处理。连续发酵一般将培养物保持于恒定高密度下，其 中细胞主要处于对数期生长中。连续发酵允许细胞生长和/或产物浓度的调节。例如，将有 限的营养物质诸如碳源或氮源保持在固定比率下并且允许所有其它参数适度。因为生长保 持在稳态，所W由于排除培养基导致的细胞损失应针对发酵中的细胞生长速率来平衡。优 化连续发酵过程且使产物形成速率最大的方法是工业微生物学领域中熟知的。
[0巧9] 4.6.组合物
[0260]本发明的海藻糖酶用于各种淀粉酶底物的发酵。海藻糖酶可用于液化液的发酵。 海藻糖酶还可用于同时糖化和发酵(SSF)。海藻糖酶可W合适的抑、溫度和时间使用。使用 海藻糖酶可改善发酵培养基中酵母的健康状态，如通过增加的乙醇生产所证实，和/或海藻 糖的连续降解，如通过较低的DP2水平或海藻糖水平所证实。某些真菌海藻糖酶可对于此类 功能更有效。海藻糖酶可W任何期望浓度使用，例如在发酵中约0.化g/g至Img/g的DS。优选 的浓度包括在发酵中0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2、4、6、8、10、20、50、100蛇/邑的05。
[0261] 海藻糖酶可与葡糖淀粉酶化C 3.2.1.3)组合，例如木霉属葡糖淀粉酶或其变体。 示例性葡糖淀粉酶为里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)和其变体，它们具有优异的比活性和热稳 定性。参见美国已公布的专利申请 2006/0094080、2007/0004018 和 2007/0015266(Danisco US公司）。合适的化GA变体包括具有葡糖淀粉酶活性且具有与野生型TrGA至少80%、至少 90 %或至少95 %序列同一性的变体。a淀粉酶有利地增加化GA催化的糖化过程中所产生的 葡萄糖的收率。
[0262] 另选地，葡糖淀粉酶可为来源于植物(包括藻类）、真菌或细菌的另一种葡糖淀粉 酶。例如，葡糖淀粉酶可为黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶或它的变体（例如，Boel等人（1984) EMBO J.3:1097-1102;W0 92/00381;W0 00/04136(Novo Nordisk A/S));和泡盛曲霉 (A. awamori)葡糖淀粉酶(例如，WO 84/02921 (Cetus公司））。其它设想的曲霉属葡糖淀粉酶 包括具有增强的热稳定性的变体，例如61374和61394(化611等人（1996冲'〇1.611旨.9:499-505) ;D257E和D293E/Q(化en等人（1995化的1.611邑.8:575-582);^82(畑611等人（1994) Biochem. J.301:275-281) ;A246C(Fierobe等人（1996)Biochemis付y，35:8698-8704);和在 八435和5436位中具有?'〇残基的变体化1等人（1997冲'〇*61116叫.10:1199-1204)。其它设 想的葡糖淀粉酶包括篮状菌（TaIaromyCeS )葡糖淀粉酶，尤其来源于埃默森篮状菌 (T.emersonii)(例如，WO 99/28448(Novo Nordisk A/S)、T.Ieycettanus(例如，美国专利 RE 32,153(CPC International公司））、杜邦篮状菌（T.duponti)或嗜热篮状菌 (T. thermophi Ius)(例如，美国专利4，587，215)。设想的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属的 葡糖淀粉酶，尤其是热解淀粉梭菌（C. thermoamy Io Iyticum)(例如，EP 135138( CPC International公司）和热硫化氨梭菌（C. thermohy化OSiil化ricum)(例如，WO 86/01831 (Michigan Biotechnology InstiUite)))。合适的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀 粉酶，诸如胖0 00/04136(齡￥〇齡'山31^4/5)的560 10^):2中所示的葡糖淀粉酶。商业葡 糖淀粉酶也是合适的，诸如AMG 200L;AMG SOOL SAN? SUPER和AMG? E(Novozymes); OPTIDEX'ksOO和OPHDEX L-400(Danisco US公司）；AMIGASE?和AMIGASE? PLUS(DSM); G-ZYME'K(;9〇(KEnzyme Bio-Systems);和G-ZYME?G990ZR(具有低蛋白酶含量的黑曲 霉葡糖淀粉酶）。其它仍合适的葡糖淀粉酶包括烟曲霉(AspergiIlus fumigatus)葡糖淀粉 酶、篮状菌葡糖淀粉酶、草根霉葡糖淀粉酶、栓菌(Trame tes)葡糖淀粉酶、嗜热丝抱菌葡糖 淀粉酶、阿太菌(Athelia)葡糖淀粉酶或腐质霉化umicola)葡糖淀粉酶(例如，HgGA)。葡糖 淀粉酶通常W约0.1-2个葡糖淀粉酶单位(GAUVg ds，例如约0.16GAU/g ds、0.23GAU/g ds 或0.33GAU/g ds的量添加。
[0263] 可与海藻糖酶一起使用的其它合适的酶包括植酸酶、蛋白酶、普鲁兰酶、0-淀粉 酶、异淀粉酶、不同的O-淀粉酶、O-葡糖巧酶、纤维素酶、木聚糖酶、其它半纤维素酶、e-葡糖 巧酶、转移酶、果胶酶、脂肪酶、角质酶、醋酶、氧化还原酶或其组合。例如，支化酶诸如异淀 粉酶巧C 3.2.1.68)可W本领域的技术人员熟知的有效量添加。普鲁兰酶化C 3.2.1.41)例 如P民OMOZYME'K''也是合适的。普鲁兰酶通常WlOOU/kg ds添加。另外合适的酶包括蛋 白酶诸如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括获自曲霉属诸如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉； 毛霉属(例如，米黑毛霉(M.miehei));根霉属;和木霉属。
[0264] (6-淀粉酶化C 3.2.1.2)为外切-作用产麦芽糖淀粉酶，其催化将I，4-a-糖巧键水 解成支链淀粉酶和相关的葡萄糖聚合物，从而释放出麦芽糖。e-淀粉酶分离自各种植物和 微生物。参见Foga;rty等人（1979)P;rogress in Industrial Microbiology中，第15卷，第 112-115页。运些0-淀粉酶具有在40°C至65°C范围内的最佳溫度和在约4.5至约7.0范围内 的最佳P H。设想的0 -淀粉酶包括但不限于大麦的0 -淀粉酶S P E Z Y M E K B B A 15 0 0、 SPEZYME'kDBA'OPTIMALT? ME'OPTIMALT? BBA(Danisco US公司）；和N0V0ZYM? WBA (Novozymes A/S)。
[0265] 包含本发明的海藻糖酶的组合物可为含水或不含水的制剂、颗粒料、粉末、凝胶、 浆液、糊料等，组合物可还包含本文列出的附加酶中的任何一种或多种W及缓冲液、盐、防 腐剂、水、共溶剂、表面活性剂等等。此类组合物可结合浆液、水浴、洗涂机、食品或饮品产品 等中已经存在的内源性酶或其它成分来起作用，例如内源性植物(包括藻类)酶、先前处理 步骤的残余酶等等。 实施例
[0266] 实施例1:材料和方法
[0267] 液化所有W下基于实验室的发酵利用从工业燃料乙醇植物收集的液化液样品来 完成。液化液是在工厂收集且带回实验室用于即刻冷冻且储存。在发酵使用当天，将液化液 在水浴中升溫至发酵溫度。在发酵之前，使用硫酸将液化液抑调节至发酵的起始pH(4.8)。 因为运些液化液来自燃料乙醇植物，所W大部分回糟(也称为稀塔馈物)已用于产生运些液 化液样品。回糟的运种添加可导致工业范围发酵W可测量的海藻糖水平开始。
[0%引鍵：
[0269] 同时糖化和发酵(SSF)或发酵实验通过长期内部方案使用100g-规模发酵来进行。 所有发酵比较在S重复(n = 3)100g-规模烧瓶条件的情况下进行，并且本文显示的数据是 那些=重复发酵的平均。发酵在受控溫度(32°C等溫或36°C斜坡溫度特征图）摇动培养箱 (150巧m摇动）内进行。在酶投配之前，还将60化pm脈和0.1 %酵母(通常是干投)添加至液化 液。所有海藻糖酶投配在开始发酵时与DISTILLASE'|"SSF(GE肥NCOR的包含葡糖淀粉酶 的酶共混物)投配一起进行。仅对于实施例2，为了相等稀释比较，海藻糖酶投配包括感兴趣 的酶加上使总投配体积达到67化L(获得Sug/曲S化nT化H)所需的最大体积)所必需的体积 的水。
[0270] 样品制备:
[0271] 将发酵肉汤取样到2mL管中用于后续的3min 130(K)rpm离屯、。将0.500mL上清液等 分试样移取到玻璃管中，之后添加50化IM硫酸W使GA活性灭活。在5分钟溫育之后，利用DI 水将发酵样品稀释至IOx稀释液。运个过程为有机酸HPLC分析的取样的内部标准方案，该过 程不仅使酶在分析之前灭活，还有意地提供相当于HPLC移动相水平的背景硫酸。使用0.22y m尼龙注射器式过滤器将此样品制剂的大约ImL等分试样过滤并且置于HPLC样品小瓶中。
[0272] 对于通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换化PAEC-PAD)的离子色谱法的海藻 糖测定，将上文经IOx稀释的样本制剂的单独0. SOOmL等分试样在9mM化0H(中和之前添加 W杀死酶活性的酸）中再稀释10倍。使用0.22um尼龙注射器式过滤器将此IOOx稀释液样品 过滤到2mL IC小瓶中用于HPAEC-PAD分析。 脚引有机酸HPLC分离 惦74]柱：phen〇menex'B:ltezex?有机酸（ROA) ,300X7.80mm [0Z7引防护化：則en0menex'"'Se州rityGuard? Carbo-H筒。
[0276] 柱溫:65°C
[0277] 移动相:0.0 lN硫酸。
[027 引 流速:0.6mL/min 或 0.7mL/min
[02巧]注入体积：20化
[0280]检测:保持在40°C下的差分折射率
[誦]使用HPAE-PAD的高级碳水化合物分离:
[0282] 仪器：Dionex'" ICS-5000
[0283] 柱：Di〇l